New England Biolabs, C3030J, SHuffle® T7 Express lysY E. coli competente

¿Tiene problemas para abrir sus tubos? Categorías relacionadas Expresión SHuffle,, Cepas de expresión de proteínas de E. coli,, E. coli, Cepas de expresión, Aplicaciones Expresión T7,, Expresión de proteínas difíciles,, Expresión de proteínas con enlaces disulfuro, Especificación Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Notas de envío Envíos en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C3030)? R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de expresión de proteínas se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. Formación de enlaces disulfuro en el citoplasma: Normalmente, las reductasas en el citoplasma de E. coli mantienen las cisteínas en su forma reducida, reduciendo así cualquier enlace disulfuro que pueda formarse en este compartimento. SHuffle presenta deleciones en los genes de la glutaredoxina reductasa y la tiorredoxina reductasa (Δgor ΔtrxB), lo que permite la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma. Esta combinación de mutaciones suele ser letal, pero su letalidad se ve suprimida por una mutación en la enzima peroxirredoxina (ahpC*). Además, SHuffle expresa una versión de la isomerasa periplásmica de enlaces disulfuro DsbC, que carece de su secuencia señal, reteniéndola en el citoplasma. Se ha demostrado que esta enzima actúa sobre proteínas con múltiples enlaces disulfuro para corregir enlaces mal oxidados y promover el plegamiento adecuado. El gen de la DsbC citoplasmática está presente en el cromosoma. Control del promotor Lac (lacIq): El represor lac bloquea la expresión de los promotores lac, tac y trc, frecuentemente transportados por plásmidos de expresión. Si el nivel de represor lac en células de E. coli no es suficiente para inhibir la expresión a través de estos promotores durante la transformación o el crecimiento celular, incluso niveles bajos de expresión pueden reducir la eficiencia de la transformación y seleccionar en contra de los transformantes deseados. Las moléculas adicionales de represor lac en cepas lacIq ayudan a minimizar la actividad del promotor hasta que se añade IPTG. P: ¿Para qué aplicaciones son útiles las cepas SHuffle®? R: Las cepas SHuffle son ideales para la expresión de proteínas que requieren enlaces disulfuro para su plegamiento. La isomerasa DsbC presente en el cromosoma de las cepas SHuffle también ha demostrado ser una chaperona eficaz (Chen et al. (1999) JBC, 274, 19601-19605) y podría ayudar en el plegamiento de proteínas diana, independientemente de la formación de enlaces disulfuro. (de Marco, A. (2009) Microbial Cell Factories, 8, 26) P: ¿Mi proteína tiene enlaces disulfuro? R: Todos los citoplasmas eucariotas y procariotas conocidos contienen reductasas que participan en la reducción de enlaces disulfuro. Por lo tanto, las proteínas se oxidan para formar enlaces disulfuro solo en ciertos compartimentos extracitoplasmáticos, como el espacio periplásmico en procariotas gramnegativos o el retículo endoplasmático en eucariotas. Pueden ocurrir excepciones en ciertas arqueas termófilas como Crenarchaea y algunas bacterias termófilas (p. ej., Aquifex y Thermotoga). Existen sitios web como Phobius o SignalP que pueden usarse para predecir si una proteína se encuentra en el periplasma oxidante o en el retículo endoplasmático. Se puede tener una idea de la importancia de las cisteínas en una proteína de interés analizando cuán conservados están los residuos de cisteína en homólogos cercanos. P: ¿Qué cepa de SHuffle® debo usar? R: Hay dos versiones de SHuffle® basadas en dos cepas diferentes de E. coli. SHuffle® T7 (NEB #C3026) se basa en E. coli K12, mientras que SHuffle® Express (NEB# C3028), SHuffle® T7 Express (NEB# C3029) y SHuffle® Express T7 LysY (NEB# C3030) se basan en E. coli B. Hemos observado diferentes niveles de plegamiento y expresión dentro de las dos líneas celulares SHuffle® diferentes (K12 vs B), dependiendo de la proteína. Actualmente no podemos predecir qué línea celular SHuffle® tendrá más éxito en el plegamiento de una proteína dada con enlaces disulfuro. Por lo tanto, recomendamos comparar la expresión de su proteína de interés en ambas cepas SHuffle® (NEB #C3026 y #C3029) como experimento inicial. Una vez que se decide el tipo de cepa SHuffle® óptimo, se recomienda la optimización de las condiciones de expresión (por ejemplo, temperatura, potencia y tiempo del inductor, etc.). Todas las cepas SHuffle se pueden usar para promotores que no sean T7 (por ejemplo, vectores de expresión de los promotores lac y ara). Para los vectores de expresión del promotor T7, recomendamos SHuffle T7 Express (NEB #C3029) o SHuffle T7 (NEB #C3026). Para la expresión tóxica del promotor T7, recomendamos SHuffle® T7 Express lysY (NEB #C3030). P: ¿Puedo aumentar la producción de proteínas con cepas SHuffle? R: Intente variar la intensidad de inducción, la duración y la temperatura para encontrar las condiciones óptimas de expresión. Disminuir la intensidad de expresión puede mejorar la producción. P: ¿Cuáles son las características de crecimiento de las cepas SHuffle? R: Las cepas SHuffle alcanzan densidades ópticas finales similares a las de sus cepas parentales silvestres. Sin embargo, hemos observado una fase de latencia prolongada en las cepas SHuffle en comparación con las células silvestres. P: ¿Cómo contribuyen las cepas SHuffle® a la formación de enlaces disulfuro citoplasmáticos? R: SHuffle es una cepa mutante de E. coli que carece de las dos reductasas (trxB y gor) y presenta una mutación supresora adicional (ahpC) que restaura la viabilidad, permitiendo la formación de enlaces disulfuro estables en el citoplasma. En estas condiciones, las tiorredoxinas se encuentran en su estado oxidado, convirtiéndolas de reductasas a oxidasas. Por lo tanto, las proteínas que requieren enlaces disulfuro para su plegamiento pueden oxidarse y formar enlaces disulfuro estables en el citoplasma. Además, las cepas SHuffle expresan la isomerasa de enlaces disulfuro DsbC en el citoplasma. Esta característica mejora considerablemente la fidelidad de la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma, y ​​las proteínas con múltiples enlaces disulfuro se oxidan correctamente con rendimientos significativamente mayores. P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de a -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en una disminución significativa de la eficiencia de transformación (ET). Al analizar la E. coli competente NEB 5-alfa (NEB n.° C2987H), las células perdieron el 94,5 % de TE tras solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. El 98,9 % de TE se observó en 2 días y el 99,6 % tras una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Cómo debo expresar la proteína de interés en SHuffle? R: Para las condiciones iniciales, recomendamos usar un medio rico a 30 °C. De lo contrario, es posible mantenerlo durante toda la noche a 16 °C. A 30 °C o 16 °C, inocule el 1 % del cultivo nocturno y cultive las células a 30 °C durante 3 horas hasta obtener una DO600 de ~ 0,8. A continuación, induzca la expresión de la proteína durante al menos 5 horas a 30 °C o durante toda la noche a 16 °C. Si se usan 37 °C, inocule el 1 % del cultivo de la noche y cultive las células durante 2 horas a 37 °C hasta que OD600 ~ 0,8 y luego induzca la expresión de la proteína durante al menos 6 horas a 37 °C. P: ¿Es necesario agregar estreptomicina y/o espectinomicina cuando se cultivan cepas SHuffle? R: No, la resistencia a estos antibióticos se debe a los genes integrados de forma estable en el cromosoma. Se deben evitar los plásmidos de expresión con marcadores de resistencia a estreptomicina o espectinomicina. P: ¿Puedo realizar experimentos de presentación de fagos M13 en cepas SHuffle? R: No. Las células SHuffle Express (C3028, C3029, C3030) no albergan el episoma F' y, por lo tanto, no pueden ser infectadas por M13. Por otro lado, aunque las células SHuffle T7 (C3026) portan el F', no son susceptibles a la infección por M13. Esto puede deberse a que el citoplasma oxidativo interfiere con el ensamblaje del fago. P: ¿Puedo realizar un cribado azul/blanco usando complementación alfa de lacZ en cepas SHuffle? R: No, las cepas SHuffle no tienen la deleción M15 apropiada en el gen lacZ para la complementación alfa. Las células SHuffle (E. coli K12, C3026) y SHuffle express (E. coli B, C3028) son lacZ+, mientras que las células SHuffle T7 express (E. coli B, C3029 y C3030) son lacZ-. P: ¿Qué cepas SHuffle son resistentes al cloranfenicol? ¿Es necesario el cloranfenicol para el mantenimiento del plásmido mini F? R: Solo las E. coli SHuffle® T7 Express lysY Competent (NEB #C3030) son resistentes a Cam. La resistencia a Cam se debe al miniF que porta el gen lysY. La cepa SHuffle® T7 Express de E. coli competente (NEB n.° C3029) es sensible a Cam. No es necesario añadir Cam para propagar el miniF. No recomendamos añadir Cam a cultivos de SHuffle® T7 lysY Competent E. coli (NEB n.° C3027) ni de SHuffle® T7 Express lysY Competent E. coli (NEB n.° C3030). Existe una copia del gen de resistencia a Cam en el miniF, por lo que no se pueden utilizar concentraciones estándar de Cam (33 microgramos por ml). Si se añade cloranfenicol, utilice solo 10 µg/ml. P: ¿Crecen las células SHuffle en medios mínimos? R: Las células SHuffle express (E. coli B) (C3028, C3029, C3030) crecerán en medios mínimos, mientras que SHuffle (E. coli K12) es un auxótrofo y requerirá la adición de isoleucina y leucina (50 ug/ml) para el crecimiento en medios mínimos. Se pueden preparar soluciones madre 100X de Ile/Leu disolviendo 5 mg/ml de los aminoácidos en agua y esterilizando por filtración la solución. P: ¿Son sensibles a la temperatura las cepas SHuffle? R: Las células SHuffle express son sensibles a temperaturas elevadas y no crecen a 42 °C. Pero a temperaturas de 37 °C e inferiores, tanto las células SHuffle express (E. coli B) como las SHuffle (E. coli K12) son viables. Por lo tanto, sugerimos cultivar células SHuffle a temperaturas sin estrés de 30 °C e inducir la expresión de su proteína a temperaturas aún más bajas. P: ¿Está disponible el genoma de las cepas SHuffle? R: Sí. Puede leer el artículo que describe el genoma completo anotado de las versiones K-12 de SHuffle (C3026) y B (C3029) en Anuncios del Genoma (31 de marzo de 2016;4(2). Las secuencias genómicas completas anotadas están depositadas en el EMBL, EBI, con los siguientes números de acceso de ensamblaje: NEB T7 express (C2566), CP014268; SHuffle-B (C3029), CP014269; DHB4, CP014270, y su episoma F′ cognado, CP014271; y SHuffle K-12 (C3026), CP014272, y su episoma F′ cognado, CP014273. P: ¿La expresión de T7 está sujeta a represión catabólica en las cepas NEB T7 Express o SHuffle? R: El gen de la ARN polimerasa T7 se clona en el operón lac cromosómico. Dado que la expresión está controlada por el operón lac wt, la adición de glucosa provocará la represión catabólica. Por lo tanto, la expresión basal de la proteína de los vectores promotores T7 se controlará mejor cuando la glucosa esté presente en el medio. Cuando el glicerol es la principal fuente de carbono, no debería haber ningún efecto sobre el operón lac. P: ¿Se pueden utilizar células SHuffle para secretar la proteína de interés? R: Aunque las células SHuffle tienen un aparato de secreción intacto, no se recomienda la producción periplásmica de proteínas mediante células SHuffle. Las proteínas que requieren enlaces disulfuro para su plegamiento pueden oxidarse en el citoplasma, antes de su secreción, lo que bloquea la secreción de la proteína.