New England Biolabs, C3037I, NEBExpress® Iq Competent E. coli (Alta Eficiencia)

¿Tiene problemas para abrir sus tubos? Categorías relacionadas Expresión no T7,, Cepas de expresión de proteínas de E. coli,, E. coli, Cepas de expresión, Aplicaciones Expresión no T7,, Expresión de proteínas en, E. coli, ,, Especificación de expresión de proteínas Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Estreptomicina 25 µg/ml Tetraciclina 15 µg/ml Notas de envío Envíos en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿New England Biolabs ofrece cepas de E. coli competentes adecuadas para la expresión de proteínas? R: Sí, tenemos varias cepas para la expresión de proteínas. BL21(DE3) (NEB #C2527) se ofrece para la expresión de rutina de T7 y BL21 (NEB #C2530) para la expresión no T7. NEBExpress (NEB #C2523) es un derivado mejorado de BL21, y NEB Express Iq (NEB #C3037) ofrece una expresión estrictamente controlada a partir de vectores con promotores lac, tac, trc o T5-lac0. T7 Express Competent E. coli (NEB #C2566) y T7 Express Iq Competent E. coli (NEB #C3016) son derivados mejorados de BL21(DE3). La cepa lacIq permite un control más preciso de la expresión. Ambas están disponibles con la función lysY para un control excepcional de la expresión (T7 Express lysY, NEB #C3010 y T7 Express lysY/Iq, NEB #C3013). NEB también ofrece cepas SHuffle™ capaces de plegar correctamente proteínas con múltiples enlaces disulfuro en el citoplasma. SHuffle™ Express (NEB #C3028H) puede utilizarse con promotores distintos de T7 o SHuffle™ Express T7 (NEB #C3029H) para vectores de expresión del promotor T7. Para la expresión del promotor T7 tóxico, SHuffle™ Express T7 lysY (NEB #C3030H) es ideal. Estas tres cepas también se ofrecen como cepas K12: SHuffle™ (NEB #C3025H), SHuffle™ T7 (NEB #C3026H) y SHuffle™ T7 lysY (NEB #C3027H). Lemo21(DE3) (NEB #C2528) está disponible para la expresión ajustable de dianas complejas, como proteínas de membrana, proteínas tóxicas y proteínas con tendencia a la expresión insoluble. NiCo21(DE3) (NEB #C2529) está diseñado para la expresión y purificación rutinarias de proteínas marcadas con His. P: ¿Cuánto tiempo debo incubar las células en hielo después de añadir el ADN (NEB n.° C3037H y NEB n.° C3037I)? R: Se recomienda incubar el ADN con células competentes NEB Express Iq en hielo durante 30 minutos. Se espera una pérdida de aproximadamente el 40 % en la eficiencia de transformación al incubar durante 10 minutos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Cuáles son las soluciones/recetas (C3037)? R: SOB: 2 % de peptona vegetal (o triptona), 0,5 % de extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl₂, 10 mM de MgSO₂. SOC: SOB + 20 mM de glucosa. Agar LB: 1 % de triptona, 0,5 % de extracto de levadura, 0,17 M de NaCl, 1,5 % de agar. P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C3037)? A: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de expresión de proteínas se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. Deficiencia de proteasa ([lon] ompT): Las cepas de E. coli B presentan deficiencia natural de la proteasa lon, que en las cepas K-12 sirve para degradar las proteínas mal plegadas y evitar la acumulación de algunas proteínas específicas del ciclo celular. La proteasa OmpT reside en la superficie de la E. coli silvestre, tanto en las cepas K-12 como B, lo que presumiblemente ayuda a las células a obtener aminoácidos de su entorno externo. Las células deficientes en ambas proteasas son mucho más susceptibles a la producción de proteínas a partir de genes clonados. Control del promotor Lac (lacIq): El represor Lac bloquea la expresión de los promotores lac, tac y trc, frecuentemente presentes en plásmidos de expresión. Si el nivel de represor Lac en células de E. coli no es suficiente para inhibir la expresión a través de estos promotores durante la transformación o el crecimiento celular, incluso niveles bajos de expresión de genes tóxicos pueden reducir la eficiencia de la transformación y seleccionar en contra de los transformantes deseados. Las moléculas adicionales de represor Lac en las cepas lacIq ayudan a minimizar la actividad del promotor hasta que se añade IPTG. Recuperación del daño del ADN (sulA11): Las células de E. coli pueden tolerar una cantidad sustancial de daño crónico del ADN siempre que se permita la reparación. Esta capacidad se ve comprometida si las células no pueden dividirse después de la reparación. En las células lon-, SulA, un inhibidor de la división celular, se acumula y provoca hipersensibilidad celular al daño del ADN. La mutación sulA permite que las células se dividan con mayor normalidad en ausencia de la proteasa Lon. Deficiencia de endonucleasa I (endA): El espacio periplásmico de las células de E. coli de tipo silvestre contiene una endonucleasa inespecífica. Se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Restricción deficiente: (Δ(mcrC-mrr)114::IS10) Las cepas de E. coli B de tipo salvaje llevan una endonucleasa de restricción de tipo I que escinde el ADN con el sitio TGA(N8)TGCT. Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa cognada, el ADN extraño se cortará en estos sitios. La deleción descrita anteriormente elimina tanto la metilasa como la endonucleasa. Fago resistente T1: (fhuA2) T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La deleción de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB #C3037H y NEB #C3037I? R: Son las mismas células con la misma eficiencia pero se proporcionan en diferentes formatos. El C3037H se presenta en 20 tubos de transformación de un solo uso, cada uno con 50 μl de células competentes. Para mayor comodidad, se puede añadir el plásmido o el producto de ligación directamente a los tubos de transformación. El C3037I se presenta en 6 tubos, cada uno con 200 μl de células competentes. Los tubos deben descongelarse en hielo y transferirse 50 μl de células a nuevos tubos antes de la transformación. Cada tubo contiene suficientes células para 4 transformaciones, lo que reduce el coste de cada una. Si se realizan 3 o 4 transformaciones a la vez, el C3037I resulta rentable. No se recomienda volver a congelar las células competentes después de la descongelación, ya que esto reducirá significativamente la eficiencia de la transformación. P: ¿Cuál es el tiempo óptimo de choque térmico para esta cepa (NEB n.° C3037H y NEB n.° C3037I)? R: El choque térmico a 42 °C durante 20 segundos da como resultado la mayor eficiencia de transformación para E. coli competentes para NEB Express Iq (NEB #C3037H y NEB #C3037I). Espere aproximadamente una pérdida del 50 % en la eficiencia de transformación cuando el choque térmico durante 80 segundos (consulte la figura en la página principal del producto). P: ¿Por qué no hay colonias o no hay crecimiento en el cultivo líquido (C3037)? R: Puede haber expresión basal en el huésped NEB Express. Si es probable que la proteína expresada sea tóxica, » La incubación a 30 °C o temperatura ambiente puede aliviar los problemas de toxicidad. » Además, verifique la concentración de antibiótico (pruebe con el plásmido de control). P: ¿Por qué la proteína inducida es insoluble (C3037)? R: Verifique la insolubilidad: esto es importante porque una alta expresión y alta producción de proteína puede resultar en que la proteína diana se vuelva insoluble. Las posibles soluciones para esto son: » Inducir a temperaturas más bajas (tan bajas como 12-15 °C durante la noche) » Reducir la concentración de IPTG a entre 0,01 mM y 0,1 mM » Inducir durante menos tiempo (tan solo 15 minutos) » Inducir más temprano en el crecimiento (OD600 = 0,3 o 0,4) P: ¿Por qué no hay proteína visible en el gel o no hay actividad (C3037)? R: Verifique la toxicidad: la ausencia de proteína puede significar que las células han eliminado o eliminado elementos en el plásmido de expresión. » Cultivar células para la inducción de proteínas. Justo antes de la inducción, coloque una muestra en placas duplicadas con y sin selección de antibiótico. Si la toxicidad es un problema, habrá una diferencia significativa entre el número de colonias en las placas. Se verán menos colonias en las placas que contienen antibiótico (lo que indica que se ha perdido el plásmido) en comparación con las placas sin antibiótico. P: ¿Puedo almacenar células competentes a -20 °C en lugar de -80 °C? R: Las células competentes deben almacenarse a -80 °C. El almacenamiento a -20 °C resultará en una disminución significativa en la eficiencia de transformación (TE). Cuando se probó en NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB #C2987H), las células perdieron el 94,5% de TE después de solo 24 horas de almacenamiento a -20 °C. Las células perdieron el 98,9% de TE después de 2 días y el 99,6% de TE después de una semana de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Cuál es la vida útil para esta cepa (NEB #C3037H y NEB #C3037I)? R: La fecha de vencimiento es de dos años a partir de los datos de ensayo proporcionados con el producto. P: ¿Qué tipo de tubos de transformación se deben usar? R: En comparación con el tubo de 2,0 ml proporcionado con las células competentes de formato de un solo uso de NEB, el tubo Eppendorf de 1,5 ml que probamos funcionó bien. P: ¿Qué volumen de ADN se puede agregar a las células competentes? R: El volumen de ADN que se agrega a las células competentes afecta la eficiencia de transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) para 50 µl de células competentes. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de transformación cae al 52% cuando el volumen de ADN aumenta a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación cae al 18% cuando el volumen de ADN aumenta a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación cae al 5,2% cuando el volumen de ADN aumenta a 50 µl (de 2 µl). P: ¿Son las células competentes de NEB compatibles con el protocolo "Mix & Go"? R: Existe un protocolo "Mix and Go" que proporciona una forma rápida de transformar sus células simplemente agregando plásmido a las células y sembrando en placa. No se requiere un paso de choque térmico. NEB ha probado nuestras células competentes en este protocolo contra el producto "Mix & Go" de otra compañía. Hemos observado que ambos producirán números similares de colonias; Sin embargo, las colonias de NEB son más grandes con el mismo período de incubación. P: ¿Es necesaria la selección con antibióticos para mantener el plásmido MiniF-lacIq? R: Aunque el plásmido MiniF contiene el gen de resistencia al cloranfenicol, no es necesario añadir cloranfenicol. Si se añade, la concentración final de cloranfenicol debe ser de 10 μg/ml. Niveles de cloranfenicol superiores a 15 μg/ml afectarán el crecimiento.