New England Biolabs, C3040I, NEB® E. coli estable y competente (alta eficiencia)

Químicamente competente Categorías relacionadas Clonación Cepas celulares competentes Aplicaciones Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento, Especificación de transformación Antibiótico para selección de plásmidos Antibióticos para selección de plásmidos Concentración de trabajo Ampicilina 100 µg/ml Carbenicilina 100 µg/ml Cloranfenicol 33 µg/ml Kanamicina 30 µg/ml Notas de envío Envíos en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Qué cepas celulares competentes son compatibles con Gateway® Cloning? R: NEB 5-alfa (NEB #C2987) y NEB 10-beta (NEB #C3019) E. coli competentes se pueden utilizar con Gateway Cloning. P: ¿Cuáles son las propiedades de la cepa (C3040)? ​​R: Las propiedades de esta cepa que contribuyen a su utilidad como cepa de clonación se describen a continuación. Los genotipos subyacentes a estas propiedades aparecen entre paréntesis. Cribado azul/blanco (Φ80 Δ(lacZ)M15): produce el fragmento omega de β-gal; lacX74 elimina el gen β-gal en el cromosoma. pUC19 y plásmidos similares codifican el péptido α de la β-galactosidasa (lacZ). El péptido α puede combinarse con el fragmento omega de la β-galactosidasa que se transporta en el F' (α-complementación). Cuando la β-galactosidasa se reconstituye de esta manera, puede escindir X-gal y da como resultado colonias azules en una placa de X-gal. Los insertos clonados en el polienlazador plasmídico interrumpen el gen del péptido α y las colonias son blancas. Recombinación deficiente: (recA1) E. coli tiene un sistema de reparación que recombinará secuencias homólogas. Los clones genómicos suelen presentar regiones duplicadas, y los reordenamientos mediados por recA pueden ser problemáticos, especialmente cuando las regiones de homología superan los 50 pb. Las cepas con la función recA eliminada tienden a crecer más lentamente que las cepas recA+. Deficiencia de endonucleasa I (endA1): El espacio periplásmico de las células de E. coli de tipo silvestre contiene una endonucleasa inespecífica. Se debe tener mucho cuidado para evitar la degradación de los plásmidos preparados a partir de estas células. La mutación endA elimina esta endonucleasa y puede mejorar significativamente la calidad de las preparaciones de plásmidos. Restricción deficiente [Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]: Las cepas silvestres de E. coli K12 poseen una endonucleasa de restricción que escinde el ADN con los sitios AAC(N6)GTGC y GCAC(N6)GTT. Si bien el ADN de E. coli está protegido de la degradación por una metiltransferasa afín, el ADN extraño se corta en estos sitios. La deleción descrita anteriormente elimina tanto la metilasa como la endonucleasa. Restricción deficiente de metilo [mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]: E. coli posee un sistema de enzimas, mcrA, mcrB y mrr, que escinde el ADN con patrones de metilación presentes en eucariotas superiores, así como en algunas cepas vegetales y bacterianas. El ADN derivado de fragmentos de PCR, ADNc o ADN previamente propagado en E. coli no se metilará en estos sitios y no se escindirá. Los tres Mcr Las enzimas se han inactivado en NEB 10-beta, lo que permite la introducción de ADN eucariota de origen genómico (p. ej., bibliotecas primarias) si se desea. Fago resistente T1 (fhuA): T1, un fago extremadamente virulento, requiere el receptor de captación de hidroxamato férrico de E. coli para su infectividad. La eliminación de este gen confiere resistencia a este tipo de fago, pero no afecta significativamente las características de transformación o crecimiento de la célula. Control del promotor Lac (lacIq): El represor lac bloquea la expresión de los promotores lac, tac y trc, frecuentemente presentes en plásmidos de expresión. Si el nivel de represor lac en células de E. coli no es suficiente para inhibir la expresión a través de estos promotores durante la transformación o el crecimiento celular, incluso niveles bajos de expresión pueden reducir la eficiencia de la transformación y provocar la selección contra los transformantes deseados. Las moléculas adicionales de represor lac en las cepas lacIq ayudan a minimizar la actividad del promotor hasta que se añade IPTG. P: ¿Cuál es la vida útil de esta cepa? R: La fecha de caducidad es de un año. A partir de la fecha de ensayo proporcionada con el producto. P: ¿Qué cepa de E. coli competente debo usar para la clonación general? R: NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB #C2987) es un derivado de alta eficiencia de DH5α™, la cepa de clonación estándar de la industria. NEB Turbo Competent E. coli (NEB #C2984) y NEB 5-alpha F'Iq Competent E. coli (NEB #C2992) permiten la clonación de genes potencialmente tóxicos gracias al estricto control de la expresión por lacIq y son adecuados para el cribado azul/blanco. NEB Turbo Competent E. coli (NEB #C2984) ofrece una velocidad inigualable para sus transformaciones, con colonias visibles después de tan solo 6,5 horas y capacidad de preparación de plásmidos después de 4 horas. NEB 10-beta Competent E. coli (NEB #C3019) es un derivado de DH10B™ y puede usarse para la transformación. Plásmidos grandes y BAC. La E. coli competente para dam/dcm (NEB n.° C2925) se puede utilizar para el crecimiento de plásmidos sin metilación. Si la eficiencia de la clonación se ve afectada negativamente por elementos repetitivos de ADN en el vector o la secuencia del inserto, se recomienda la E. coli competente estable NEB (NEB n.° C3040). (Consulte el protocolo para la clonación de ADN con elementos repetidos). ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El muestreador de E. coli competente para clonación NEB (NEB n.° C1010) le permite muestrear 4 de nuestras populares cepas químicamente competentes. P: ¿Son las células de E. coli competentes estables NEB adecuadas para la transformación de plásmidos grandes y productos NEBuilder HiFi, Gibson Assembly o Golden Gate Assembly de gran tamaño? R: Sí, se recomienda la E. coli químicamente competente NEB Stable para plásmidos grandes y productos NEBuilder HiFi, Gibson Assembly y Golden Gate Assembly de gran tamaño. P: ¿Cómo debo calcular la eficiencia de transformación (C3040)? ​​R: La eficiencia de transformación se define como el número de Unidades formadoras de colonias (ufc) que se producirían al transformar 1 µg de plásmido en un volumen dado de células competentes. El término es algo engañoso, ya que 1 µg de plásmido rara vez se transforma realmente. En cambio, la eficiencia se calcula rutinariamente transformando 100 pg-1 ng de plásmido superenrollado altamente purificado en condiciones ideales. Si planea calcular la eficiencia para comparar células o ligaduras, tenga en cuenta las numerosas variables que afectan a esta métrica. Ecuación de eficiencia de transformación (ET): E = Colonias/µg/Dilución Colonias = el número de colonias contadas en la placa µg = la cantidad de ADN transformado expresada en µg Dilución = la dilución total del ADN antes de la siembra Ejemplo de cálculo de EET: Transforme 2 µl (100 pg) de ADN de control pUC19 en 50 µl de células, aumente el crecimiento añadiendo 250 µl de NEB 10-beta/Medio de Crecimiento Estable y diluya 10 µl Hasta 1 ml en medio de crecimiento estable NEB 10-beta antes de sembrar 30 µl. Si se cuentan 150 colonias en la placa, el TE es: Colonias = 150 µg ADN = 0,0001 Dilución = 10/300 x 30/1000 = 0,001 TE = 150/0,0001/0,001 = 1,5 x 109 ufc/µg P: ¿Cuál es el choque térmico óptimo para esta cepa? (C3040) R: El choque térmico a 42 °C durante 30 segundos produce la mayor eficiencia de transformación para E. coli competente estable NEB. P: ¿Qué volumen de ADN se puede añadir a las células competentes? R: El volumen de ADN que se añade a las células competentes afecta la eficiencia de transformación. Se recomiendan de 1 a 5 µl de ADN (plásmido o producto de ligación) por cada 50 µl de células competentes. células. En 50 µl de células competentes, la eficiencia de transformación disminuye al 52 % cuando el volumen de ADN aumenta a 10 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 18 % cuando el volumen de ADN aumenta a 20 µl (de 2 µl). La eficiencia de transformación disminuye al 5,2 % cuando el volumen de ADN aumenta a 50 µl (de 2 µl). P: ¿Es NEB Stable adecuado para transformaciones de plásmidos más grandes? R: Sí. NEB ha transformado con éxito un plásmido de 24 kb. Cuando se transformó una cantidad igual de moléculas de ADN, la eficiencia de transformación para el plásmido de 24 kb fue de aproximadamente el 80 % en relación con pUC19 (que tiene un tamaño de 2,7 kb). P: ¿Es NEB Stable un sustituto de Stbl2 o Stbl3? R: Sí, NEB Stable se recomienda en todos los experimentos de clonación difíciles. El genotipo de NEB Stable no está relacionado con el de Stbl2 o Línea celular Stbl3, pero el rendimiento de NEB Stable es superior. El rendimiento de las tres cepas se evaluó mediante la clonación de un fragmento de ADN con 5 repeticiones de 32 pb. El constructo de prueba se denomina pUC-5xREP y se creó mediante el método de clonación Gibson Assembly. Tras la transformación de la reacción Gibson Assembly en la cepa respectiva, se analizó la estabilidad del inserto 5xREP mediante PCR de colonias: las colonias Stbl2 alcanzaron 1 mm de diámetro en aproximadamente 24 horas a 30 °C. Todas estas colonias portaban clones plasmídicos con deleciones (33 de las 33 colonias analizadas). Las colonias Stbl3 alcanzaron 1 mm de diámetro en 18-20 horas a 30 °C. De las 33 colonias analizadas, 22 contenían el inserto 5xREP de longitud completa (67 % de aciertos). Las células NEB Stable crecen bien a 30 °C y se obtienen colonias de 1 mm de diámetro después de 18-20 horas a 30 °C. La estabilidad del inserto 5xREP fue óptima al utilizar NEB Stable como cepa de clonación (97 % de aciertos, 32 de 33 colonias analizadas). Cabe destacar que NEB Stable presenta la mutación endA (a diferencia de Stbl3), por lo que los plásmidos aislados están libres de endonucleasa I. P: ¿Qué tipo de células competentes son adecuadas para la transformación de las construcciones de ADN creadas con NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix? R: Las construcciones de ADN resultantes son compatibles con la mayoría de las células competentes de E. coli. NEB recomienda utilizar NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency, NEB n.° C2987). Si los productos ensamblados superan los 15 kb, NEB recomienda utilizar NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency, NEB n.° C3019) o NEB 10-beta Electrocompetent E. coli (NEB n.° C3020). Si los genes ensamblados contienen secuencias repetitivas, NEB Stable Competent E. coli (NEB #C3040) debe utilizarse. ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El muestreador de E. coli competente para clonación NEB (NEB #C1010) le permite muestrear 4 de nuestras cepas químicamente competentes más populares. P: ¿Cómo debo almacenar el medio de crecimiento estable NEB 10-beta? R: El medio de crecimiento estable NEB 10-beta se puede almacenar a 4 °C o a temperatura ambiente, dependiendo de la rapidez con la que se vaya a utilizar. El almacenamiento a temperatura ambiente es conveniente y adecuado para usos a corto plazo (de semanas a un par de meses). Para el almacenamiento a largo plazo, recomendamos almacenar a 4 °C. P: ¿Las E. coli competentes estables NEB requieren un período de recuperación del crecimiento después de la transformación con plásmidos AmpR? R: Las reacciones de transformación con plásmidos AmpR no requieren un período de crecimiento después de la adición del medio de crecimiento. La selección de plásmidos con antibióticos distintos de la ampicilina requiere un período de crecimiento de 60 minutos a 30 °C antes de sembrar en medios selectivos. Se pueden usar 30 °C o 37 °C para la incubación en placa; sin embargo, se recomienda 30 °C, ya que algunas construcciones pueden ser inestables a temperaturas elevadas. P: ¿Cómo se deben preparar los fragmentos para el ensamblaje con NEBuilder HiFi? R: Los fragmentos se pueden preparar mediante los siguientes métodos: Los fragmentos generados por PCR se pueden limpiar con la columna Monarch PCR o el kit de limpieza rápida de PCR Exo-CIP si la pureza del amplicón es superior al 95 %. Si se utilizó ADN plasmídico como plantilla durante la PCR, se puede eliminar mediante tratamiento con DpnI si es necesario. Si se observan múltiples bandas, se recomienda optimizar la PCR. Si esto no es posible, se recomienda la purificación en gel. La extracción en gel puede introducir tiocianato de guanidina (del tampón de disolución), lo que puede reducir la eficiencia de la reacción de ensamblaje. Para minimizar esta contaminación, recorte el corte de gel para poder utilizar una menor cantidad de tampón de disolución. Se puede realizar la digestión con enzimas de restricción de un plásmido seguida de... Inactivación térmica o purificación en columna. Los fragmentos comercialmente ordenados pueden resuspenderse en agua sin nucleasas o tampón TE y usarse directamente en la reacción de ensamblaje.