New England Biolabs, E0552S, Kit de mutagénesis dirigida Q5® (sin células competentes)

Categorías relacionadas Síntesis de sgRNA, Ensamblaje de ADN, Kits de clonación y mutagénesis Aplicaciones Mutagénesis dirigida al sitio, Mutagénesis dirigida al sitio Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Células de E. coli químicamente competentes Placas de selección de medios de crecimiento SOC Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es el número máximo de nucleótidos que se pueden insertar con este kit? R: Debido al diseño de cebador back-to-back, se pueden tolerar de forma rutinaria inserciones de hasta 100 nucleótidos añadiendo hasta 50 nucleótidos al extremo 5' de cada cebador. Tenga en cuenta que se recomienda la purificación por HPLC o PAGE para cualquier cebador mayor de 60 nts. P: ¿Cuál es la distancia máxima que se puede tolerar entre sustituciones? R: Debido al diseño de cebador back-to-back, las mutaciones dentro de los 100 nucleótidos entre sí se pueden realizar de forma rutinaria en un solo paso. Tenga en cuenta que se recomienda la purificación por HPLC o PAGE para cualquier cebador mayor de 60 nts. P: Normalmente, ¿qué porcentaje de transformantes tendrá la mutación deseada incorporada? R: Gracias a la polimerasa de alta fidelidad y al robusto paso de tratamiento con KLD, la frecuencia de mutaciones deseadas es bastante alta (>90 % en la mayoría de los experimentos). Cuando se observan mutaciones no deseadas, estas suelen estar en el sitio de ligadura del plásmido. P: ¿Qué es la mezcla KLD? R: La mezcla KLD contiene una combinación de enzimas quinasa, ligasa y DpnI en un tampón que preserva la actividad de las enzimas. Esta formulación permite una fosforilación eficiente, la ligadura/circularización intramolecular y la eliminación de la plantilla en un solo paso de reacción de 5 minutos a temperatura ambiente. P: ¿Qué tipos de células competentes son compatibles con este kit? A: Se ha demostrado que las siguientes células competentes de E. coli funcionan con este kit: NEB #C2987, NEB 5-alpha (High Efficiency) (recomendación estándar) NEB #C2992, NEB 5-alpha F'Iq (High Efficiency) NEB #C3019, NEB 10-beta (High Efficiency) NEB #C2984, NEB Turbo NEB #C2566, T7 Express NEB #C3029, Shuffle® T7 Para mayor comodidad, ofrecemos una versión del kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 preenvasado con células C2987 NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) en el número de producto E0554. Se pueden sustituir otras cepas de E. coli químicamente competentes adecuadas para la clonación. Los resultados variarán según la calidad y la eficiencia de las células. Las células electrocompetentes no son compatibles con este kit a menos que se añada un paso de purificación en columna de centrifugación (intercambio del tampón con agua) antes de la transformación. P: Si duplico el tamaño de mi PCR, ¿debería añadir más mezcla de PCR a la reacción KLD? R: No. La mezcla enzimática 10X KLD está formulada para funcionar bien con 1 μl de la mezcla de PCR, independientemente del volumen de la PCR. P: ¿Por qué falta la mutación deseada en los transformantes que cribé? R: Aunque este no es un resultado común, hay algunas causas conocidas para los transformantes de fondo: 1) exceso de plásmido en la PCR, 2) selección contra estructuras de ADN específicas como repeticiones invertidas o en tándem, y 3) selección contra la proteína recombinante por las células huésped de E. coli. P: ¿Por qué no veo mi producto de PCR después de usar el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5®? R: El diseño correcto del cebador y la determinación de la temperatura de hibridación son muy importantes. Se recomienda encarecidamente el uso de NEBaseChanger, la herramienta de diseño de cebadores para mutagénesis dirigida en línea de NEB, para determinar el diseño y la temperatura de annealing. Además, asegúrese de que 1) la concentración del plásmido molde esté entre 1 y 25 ng, 2) la concentración final del cebador sea de 0,5 µM y 3) el tiempo de extensión sea de 20-30 segundos por kb de plásmido. P: ¿Qué tamaños de plásmidos se pueden amplificar con el kit de mutagénesis dirigida Q5®? R: Aún no se ha determinado el límite superior para el tamaño del plásmido. Hasta la fecha, se han amplificado con éxito plásmidos de hasta 20 kb. P: ¿Debo purificar mi plásmido antes o después de la reacción KLD al utilizar el kit de mutagénesis dirigida Q5®? R: No, la purificación no es necesaria. P: ¿Cómo diseño cebadores para usar con el kit de mutagénesis dirigida Q5®? R: Para obtener los mejores resultados, los cebadores consecutivos deben diseñarse utilizando nuestro software de diseño de cebadores en línea, que puede encontrar en: NEBaseChanger.neb.com. Para obtener pautas generales de diseño de cebadores, siga las instrucciones a continuación. Tenga en cuenta que ambos cebadores no tienen que ser mutagénicos ni estar fosforilados ni purificados. Sustituciones Las sustituciones se crean diseñando un desajuste en el centro del cebador mutagénico. Incluya al menos 10 nts que sean complementarios a su plásmido en el extremo 3' del cebador. Para acomodar mutaciones grandes (de 7 a 50 por cebador), los cambios deben incorporarse en el extremo 5' del cebador mutagénico. El extremo 5' del segundo cebador comenzará en la base junto al extremo 5' del primer cebador y procederá en la dirección opuesta en la cadena complementaria. Este cebador puede ser 100% complementario a la secuencia del plásmido o puede contener desajustes, si se desea. La ausencia de cualquier superposición garantiza que se producirá una amplificación exponencial (en lugar de lineal). Deleciones Las deleciones se crean diseñando cebadores que flanquean ambos lados del área que se va a eliminar. Los dos cebadores deben diseñarse en direcciones opuestas con sus extremos 5' adyacentes al área que se va a eliminar. Los cebadores pueden ser 100% complementarios a la secuencia del plásmido o pueden contener desajustes y/o inserciones si se desea. Inserciones La secuencia que se va a insertar debe añadirse al extremo 5' del cebador mutagénico. Para inserciones >6 nts, la secuencia de inserción puede dividirse entre los dos cebadores. La mitad del inserto debe añadirse al extremo 5' del cebador directo y la otra mitad debe añadirse al extremo 5' del cebador inverso. Como se describe para las sustituciones, debe haber al menos 10 nts que sean complementarios a su plásmido en el extremo 3' de cada cebador. El tamaño máximo de la inserción está determinado en gran medida por las limitaciones de la síntesis de oligos. Se pueden acomodar de forma rutinaria inserciones de hasta 100 nts (50 nts en el extremo 5' de cada cebador) utilizando este kit. Nota: Para cebadores de más de 60 nts de longitud, se recomienda purificarlos mediante HPLC o PAGE. P: ¿Qué temperatura de annealing debo usar con el kit de mutagénesis dirigida Q5®? R: Recomendamos usar NEBaseChanger, la herramienta de diseño de cebadores en línea de NEB, para optimizar la temperatura de annealing de los pares de cebadores mutagénicos. Para conjuntos de cebadores prediseñados consecutivos, se puede aplicar la regla Tm+3, pero podría ser necesaria la optimización. Tenga en cuenta que los desajustes en el cebador mutagénico no se tienen en cuenta con los cálculos estándar de Tm, y la temperatura de annealing óptima para la ADN polimerasa Q5 High Fidelity Hot Start puede diferir significativamente de la de las polimerasas basadas en Taq. Para pares de cebadores con temperaturas de annealing cercanas a 72 °C, se puede usar un protocolo de ciclado de dos pasos sin un paso de annealing independiente. P: Utilizo el kit de mutagénesis dirigida Q5 para introducir mutaciones individuales. ¿Cómo puedo introducir múltiples mutaciones? R: NEB® ha desarrollado un protocolo que utiliza la mezcla maestra NEBuilder HiFi DNA Assembly para simplificar la construcción de múltiples mutagénesis dirigidas. La técnica implica el diseño de cebadores flanqueantes complementarios para alinear fragmentos. Esta nota de aplicación describe el uso de la mezcla maestra NEBuilder HiFi DNA Assembly para generar múltiples mutagénesis dirigidas simultáneamente. Recomendamos solapamientos de 18-20 nt, pero la longitud de los cebadores puede variar. Los cebadores se solapan completamente, como se ilustra a continuación. El objetivo es lograr Ta equilibradas para los pares de cebadores. Las mutaciones se posicionan en el centro del cebador. Debe haber suficientes bases a ambos lados, y lo más importante, en el extremo 3' de la mutación, para que el cebador se alinee correctamente con el molde. P: ¿Hay un precipitado en el fondo del tubo de la mezcla maestra? ¿Es normal? R: La mezcla maestra Q5® puede precipitar al congelarse y descongelarse. Esto no indica un problema con el producto. Para un rendimiento óptimo, descongele completamente y resuspenda el precipitado calentándolo a temperatura ambiente e invirtiéndolo suavemente hasta su completa disolución. P: ¿Puedo realizar una extracción en gel si mi producto de PCR presenta múltiples bandas? R: Sí. Si la PCR produce una amplificación fuera de la diana, es mejor optimizar la reacción al máximo. Si no se puede optimizar la PCR, recomendamos realizar una extracción en gel con el kit de extracción en gel Monarch® Spin DNA (NEB n.° T1120). Se pueden incorporar hasta 4 µl de ADN purificado a una reacción KLD. Para obtener ayuda con la optimización de la PCR, consulte estas directrices: https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with-thermophilic-dna-polymerases