New England Biolabs, E1000S, Kit de expresión de proteínas de K. lactis

Las categorías relacionadas Expresión de proteínas en levadura,, Aplicaciones de expresión de proteínas Expresión de proteínas en levadura,, Especificación de expresión de proteínas Notas de envío Envíos en hielo seco Preguntas frecuentes P: ¿Qué sistemas ofrece NEB para la expresión y purificación de proteínas? R: El sistema de fusión y purificación NEBExpress® MBP (NEB# E8201) aprovecha el fuerte promotor Ptac y las señales de inicio de la traducción de la proteína de unión a maltosa (MBP) para mejorar la solubilidad y los niveles de expresión de una proteína deseada en E. coli. El producto resultante es una proteína de fusión MBP, que luego se purifica y aísla en dos sencillos pasos: la elución de amilosa seguida de la escisión de la proteasa TEV y el aislamiento de resina de Ni dan como resultado una proteína objetivo libre de etiquetas altamente pura. El sistema IMPACT™ (NEB# E6901) utiliza elementos de empalme de proteínas diseñados (inteínas) para purificar proteínas recombinantes mediante una sola columna de afinidad de quitina. Este sistema se distingue de otros sistemas de fusión de proteínas por su capacidad para separar una proteína recombinante de la etiqueta de afinidad sin el uso de una proteasa. Además, las proteínas recombinantes nativas que poseen un tioéster C-terminal pueden aislarse para aplicaciones como la semisíntesis de proteínas y el marcaje específico de sitio. El kit de expresión de proteínas K.lactis (NEB# E1000) proporciona un método sencillo para expresar un gen de interés en la levadura Kluyveromyces lactis. Las proteínas pueden producirse intracelularmente o secretarse utilizando el vector de expresión integrativo pKLAC1 suministrado. El kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress® (NEB# E6800) es un sistema de transcripción/traducción acelular de E. coli reconstituido a partir de componentes purificados. Los factores de transcripción/traducción de E. coli (excepto los ribosomas) están marcados con His. La proteína diana puede expresarse a partir de plantillas de ADN lineal o plasmídico que contienen un promotor T7. El sistema de síntesis de proteínas de E. coli acelular NEBExpress™ (NEB #E5360) es un sistema basado en extractos derivados de células de E. coli, diseñado para la producción in vitro de alto nivel de proteína recombinante a partir de genes clonados aguas abajo de un promotor T7 en plantillas de ADN lineal o plasmídico. El aislamiento eficiente de la proteína diana recombinante puede lograrse mediante el uso de perlas magnéticas de Ni-NTA NEBExpress™ (NEB #S1423), columnas de centrifugación (NEB #S1427) o resina (NEB #S1428). Las perlas magnéticas de Ni-NTA NEBExpress™ (NEB #S1423), las columnas de centrifugación de Ni NEBExpress™ (NEB #S1427) y la resina de Ni NEBExpress™ (NEB #S1428) son una gama de productos de níquel inmovilizado para el aislamiento de proteínas marcadas con polihistidina (marcadas con His) a partir de lisados ​​celulares o reacciones de síntesis de proteínas acelulares. P: Recibí mi kit y no veo células competentes ni reactivo de transformación. ¿Dónde están? R: Las células competentes y el reactivo de transformación se empaquetan juntos (NEB n.° C1001S) y se envían por separado de la caja del kit a -80 °C. Conserve las células competentes inmediatamente a -80 °C al recibirlas. El reactivo de transformación puede almacenarse a -80 °C hasta que esté listo para su uso; sin embargo, una vez descongelado, debe permanecer a 4 °C y no volver a congelarse. La caja del kit (E1000S) debe almacenarse a -20 °C. P: He expresado mi proteína, ¿cómo la purifico? R: Recomendamos a los clientes que averigüen esto antes de comenzar con el kit. No se recomienda marcar las proteínas secretadas con secuencias de polihistidina C o N-terminales. En la mayoría de los casos notificados, las proteínas con una etiqueta de seis o diez residuos de histidina no se unirán eficazmente a las columnas de níquel y son difíciles de detectar mediante análisis Western utilizando anticuerpos anti-etiqueta HIS. Se pueden utilizar resinas de purificación convencionales, como las de intercambio aniónico y las hidrofóbicas. P: He observado que K. lactis sin transformar crece al sembrarse en el medio de selección. ¿No está funcionando la selección? R: K. lactis contiene una acetamidasa nativa débilmente activa que permite un crecimiento mínimo de células sin transformar en el medio de selección. Cuando una transformación es exitosa, este crecimiento de fondo es rápidamente superado por el de las células correctamente transformadas, que forman colonias grandes de 1 a 2 mm de diámetro. Se ha demostrado que estas colonias son casi 100 % positivas para la integración en casete. P: ¿Dónde puedo encontrar preguntas frecuentes más detalladas sobre el kit de expresión de proteínas de K. lactis? R: Puede encontrar una lista completa de preguntas frecuentes sobre la expresión de proteínas de K. lactis aquí. P: ¿Pueden darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los NEBuffers? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.