New England Biolabs, E1201L, Kit de despunte rápido™

El kit Quick Blunting™ se utiliza para convertir ADN con salientes 5' o 3' incompatibles en ADN 5' fosforilado y de extremos romos para una ligadura eficiente de extremos romos en vectores de clonación de ADN. Categorías relacionadas Aplicaciones de manipulación de ADN Blunting, Fosforilación (quinasa), PCR, Preguntas frecuentes P: ¿Qué ligasa se recomienda para ligar ADN tratado con el kit Quick Blunting? R: Se recomienda el kit NEB Quick Ligation Kit NEB #M2200. P: ¿Puedo usar ligasa regular para ligar mi producto romo? R: Sí, pero la reacción de ligadura debe incubarse durante la noche a temperatura ambiente. Se observa una eficiencia de transformación mucho menor con un tiempo de incubación más corto. P: He embotado mi ADN y ahora necesito desfosforilar la reacción con fosfatasa antártica. ¿Necesito purificar la reacción? R: Sí, la reacción deberá purificarse antes de la desfosforilación con fosfatasa antártica, CIP o cualquier otra fosfatasa comercial. La reacción puede purificarse mediante un kit de purificación comercial, extracción con fenol/precipitación con etanol o electroforesis en gel. P: ¿Es necesario purificar el producto de PCR antes de realizar el despuntado con el kit de despuntado rápido? ¿Qué métodos se pueden utilizar para purificar el producto? R: Sí, las reacciones de PCR deben purificarse antes del despuntado; recomendamos el kit Monarch PCR & DNA Cleanup. P: He digerido mi ADN y ahora quiero realizar el despuntado directamente sin purificarlo, ¿puedo añadir los reactivos de despuntado directamente a la digestión de restricción? R: Recomendamos inactivar por calor la enzima de restricción después de una digestión de restricción y antes de la reacción de despuntado. Si la digestión de restricción se ha realizado con enzimas que pueden inactivarse mediante un tratamiento térmico, después del paso de inactivación térmica, añada 0,1 volúmenes de dNTP y 1 ul de enzima despuntadora e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Si las enzimas de restricción utilizadas no se inactivan mediante un tratamiento térmico, será necesario purificar la reacción utilizando un kit de purificación comercial (recomendamos el Monarch PCR & DNA Cleanup Kit), o bien realizar la reacción en un gel de agarosa y luego extraer el ADN (recomendamos el Monarch Gel Extraction Kit), o bien realizar una extracción con fenol/cloroformo. P: He despuntado mi ADNg sonicado durante 15 minutos en lugar del tiempo de incubación recomendado de 30 minutos, ¿seguirá funcionando la reacción? R: Se observa una eficiencia de transformación ligeramente menor con incubaciones más cortas, pero la reacción seguirá funcionando. En general, se observan 1,5 veces menos transformantes cuando el producto de PCR o el ADN fragmentado/nebulizado se incuba durante 15 minutos en lugar de 30. Si se desea un tiempo de incubación de 15 minutos, aumente la mezcla de desnaturalización a 2 µl en la reacción. P: Accidentalmente omití el paso de eliminación por calor después de la reacción de desnaturalización. ¿Seguirá funcionando la ligación? R: Sí, pero podría haber un fondo más alto, ya que la polinucleótido quinasa seguirá activa y podrá fosforilar el vector.