Kit de clonación por PCR NEB® E1203S de New England Biolabs (sin células competentes)

Clonación sencilla de todos los productos de PCR, incluidos los extremos romos y TA Categorías relacionadas Kits de ensamblaje de ADN, clonación y mutagénesis Preguntas frecuentes P: ¿Cómo funciona el kit de clonación PCR NEB®? R: Los marcos de lectura abiertos que codifican 5 residuos de aminoácidos o menos son difíciles de procesar para E. coli (2,3). Estos genes pequeños, o minigenes, provocan la liberación prematura del péptido muy pequeño del ribosoma, con el último residuo de aminoácido aún unido covalentemente a su ARNt, de modo que el ARNt no está fácilmente disponible para la síntesis de proteínas. Si el vector pMiniT 2.0 se recirculariza sin un inserto, provocará una inhibición letal de la síntesis de proteínas y no se formará ninguna colonia. Si el vector pMiniT 2.0 lleva un inserto, crecerá una colonia. P: ¿Cómo puede funcionar el vector de clonación tanto con amplicones de extremos romos como con amplicones que contienen una única base saliente? R: Las mezclas contienen componentes de pulido de extremos que convierten los salientes de una sola base, como los presentes en amplicones elaborados con la ADN polimerasa Taq o mezclas basadas en Taq, en extremos romos. La forma con extremos romos puede entonces ligarse al vector pMiniT 2.0. P: ¿Afectan estos componentes de pulido presentes en la mezcla maestra la eficiencia de mi clonación si mi inserto ya tiene extremos romos? R: No. Las concentraciones de los componentes de pulido de extremos se optimizan cuidadosamente para que cualquier saliente de una sola base se elimine para formar extremos romos; los productos de PCR ya con extremos romos no se ven afectados. P: ¿Mis insertos deben tener fosfatos 5'? R: No, esta estrategia de clonación funciona bien con insertos, independientemente de si poseen fosfatos 5'. De hecho, el uso de cebadores no fosforilados para PCR elimina la posibilidad de que se clonen múltiples insertos en el vector pMiniT 2.0. P: ¿Se puede usar el kit de clonación para insertos que no sean necesariamente amplicones de PCR? R: Sí, el kit funciona igual de bien con fragmentos de restricción con extremos romos y con una sola base saliente, o con ADN sintético. P: ¿Se puede usar el kit de clonación con insertos que contengan salientes 5' o 3' mayores que el saliente de una sola base logrado mediante PCR con ADN polimerasa Taq? R: Sí, pero con menor eficiencia. Los componentes de pulido están optimizados para eliminar un saliente de una sola base. Como ejemplo extremo, la clonación de un fragmento de ADN con un saliente de 4 bases y 5' que requiere un relleno y un saliente de 5 bases y 3' que requiere una masticación resultó en 10 veces menos transformantes que los fragmentos de ADN con extremos romos o con una sola base saliente. P: ¿Puedo usar el kit de clonación PCR NEB con pMiniT 2.0 para el ensamblaje Golden Gate? R: pMiniT 2.0 no tiene sitios BsaI, por lo que puede usarse para clonar módulos Golden Gate que sí los tienen. P: ¿Es necesario purificar el producto de PCR? R: No, aunque se logran mayores eficiencias de transformación con insertos purificados. Si se usan amplicones de PCR sin purificar, use 1 μl o menos de la PCR como material de inserto para lograr una relación molar de inserto:vector de 3:1. Es especialmente importante para PCR de alto rendimiento evitar agregar un exceso de inserto que provocaría la ligadura del inserto a ambos extremos de la estructura del vector. P: ¿Puedo usar una cepa competente de E. coli diferente a la cepa NEB 10-beta proporcionada? R: Si bien este sistema de clonación funciona bien con diversas cepas celulares, es importante usar una cepa celular con un crecimiento robusto para mantener la presión de selección hacia las construcciones plasmídicas que contienen el inserto. Además de la E. coli competente NEB 10-beta (eficiencia de clonación) proporcionada en el kit de clonación por PCR NEB (NEB n.º E1202), las cepas celulares que funcionan bien con este kit de clonación incluyen NEB Turbo (NEB n.º C2984) y NEBExpress (NEB n.º C2523) E. coli competente. No se recomiendan las cepas 5-alfa, ya que su tasa de crecimiento ligeramente más lenta no admite una fuerte supresión de fondo. P: ¿Cómo puedo maximizar el número de transformantes? R: Use los períodos de tiempo sugeridos más largos para los pasos del protocolo. Si lo desea, sembrar alícuotas adicionales de 50 μl del crecimiento de 1 ml en placas adicionales, pero no sembrar más de 50 μl por placa para mantener un fondo bajo. P: ¿Puedo reducir la escala de las reacciones para usar menos vector? R: El vector usado por reacción se puede reducir de 25 ng a 10 ng. Disminuya la cantidad de inserto proporcionalmente para mantener la proporción molar óptima de inserto:vector de 3:1, así como la cantidad de Mezcla de Clonación 1 y Mezcla de Clonación 2 añadidas. P: ¿Existen límites en cuanto al tamaño de los insertos que se pueden clonar? R: NEB 10-beta permite la estabilidad de plásmidos grandes, y el pequeño tamaño de pMiniT permite la clonación de insertos grandes. Se han clonado fácilmente insertos de 4-5 kb. Tenga en cuenta que los insertos más grandes pueden requerir proporciones de inserto a vector más bajas. P: ¿Las células NEB 10-beta Competent E. coli (Cloning Efficiency) proporcionadas en el kit son las mismas que las NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency)? R: Las células son las mismas, pero difieren 10 veces en sus eficiencias de transformación. Nuestras pruebas indican que el nivel de eficiencia de clonación proporcionado permite obtener excelentes resultados para la clonación de amplicones por PCR. P: ¿Cómo puedo determinar si mis células NEB 10-beta son competentes? R: El ADN de control pUC19 incluido en el kit se proporciona en caso de que el usuario desee confirmar la competencia de las células de E. coli competentes NEB 10-beta proporcionadas. Si bien esto no se requiere rutinariamente, la eficiencia de la transformación se puede confirmar de forma independiente transformando 100 pg (2 μl del stock de 50 pg/μl) en 50 μl de células competentes y siguiendo los protocolos normales de transformación y siembra. La eficiencia de transformación resultante debe ser > 1 x 108 ufc/μg de ADN pUC19. P: ¿Se pueden mezclar las mezclas de clonación 1 y 2 antes de agregarlas a la reacción de ligación? R: Las mezclas de clonación 1 y 2 se pueden mezclar antes de configurar la reacción. Para el almacenamiento a largo plazo, las mezclas de clonación 1 y 2 deben almacenarse en sus viales separados. Almacenar las mezclas de clonación 1 y 2 juntas resultará en una actividad enzimática reducida. P: ¿Dónde se encuentran las posiciones de transcripción +1 de los promotores SP6 y T7 para la transcripción y traducción in vitro? R: La posición +1 del promotor SP6 se ​​encuentra 50 pares de bases aguas arriba del sitio de clonación para la transcripción de insertos clonados en orientación CW, mientras que la posición +1 del promotor T7 se encuentra 62 pares de bases aguas abajo del sitio de clonación para la transcripción de insertos clonados en orientación CCW. P: ¿Cuál es la diferencia entre el pMiniT original y la estructura del vector linealizado pMiniT 2.0 que ahora se incluye en el kit? R: La versión 2.0 presenta tres mejoras: Se han añadido secuencias promotoras de la ARN polimerasa T7 y SP6 que flanquean el sitio de clonación para la transcripción in vitro de insertos clonados. Adición de siete nuevos sitios de restricción, incluidos cuatro sitios de enzimas de restricción de reconocimiento de 8 bases que flanquean el sitio de clonación para permitir una linealización más sencilla aguas abajo del inserto clonado para estudios de transcripción y para aumentar las opciones para estrategias de subclonación Eliminación del sitio BsaI presente en el gen ApR a través de mutagénesis dirigida al sitio para permitir un uso más sencillo aguas abajo de los insertos/módulos clonados para el ensamblaje Golden Gate. Ambas versiones de la estructura principal del vector linealizado tienen una funcionalidad idéntica en el kit de clonación. P: Al clonar un fragmento de PCR en el vector pMiniT 2.0 proporcionado con el kit de clonación PCR NEB, ¿en qué lugar del sitio de clonación múltiple (MCS) del vector se liga el inserto? R: El inserto se ligará entre los nucleótidos 545 y 546 del vector pMiniT 2.0. Este punto de inserción se encuentra entre los sitios de reconocimiento para EcoRi y PacI en la región MCS del vector.