Kit de RT-PCR multiplex de un solo paso LunaScript®, E1555L, de New England Biolabs

Categorías relacionadas RT-PCR,, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas Aplicaciones RT-PCR,, Síntesis de ADNc,, RT-PCR y síntesis de ADNc Preguntas frecuentes P: ¿Puedo configurar mis reacciones LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR a temperatura ambiente? R: Sí. La mezcla enzimática LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR contiene la transcriptasa inversa Luna WarmStart y la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 Hot Start. Este control dual de la temperatura de las actividades enzimáticas permite la configuración de la reacción y garantiza la estabilidad de las reacciones preensambladas a temperatura ambiente. P: ¿Puedo agregar hexámeros aleatorios o cebadores oligo (dT) a las reacciones LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR? R: No se recomienda el uso de hexámeros aleatorios o cebadores oligo (dT) con las reacciones LunaScript One-Step RT-PCR. La inclusión de estos cebadores puede reducir la especificidad de la amplificación del objetivo. Además, los hexámeros aleatorios requieren una incubación a temperatura ambiente para la hibridación de cebadores; por lo tanto, no son compatibles con la transcriptasa inversa Luna WarmStart, que requiere la activación completa de WarmStart a 50 °C o más. En su lugar, recomendamos el uso de cebadores específicos para cada gen. P: ¿Puedo reducir el volumen de reacción en las reacciones LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR? R: Sí, para muchos objetivos, el volumen de reacción se puede reducir a la mitad (de los 25 µl estándar a 12,5 µl) sin comprometer el rendimiento de la PCR. Simplemente reduzca el volumen del reactivo mientras utiliza la misma cantidad de ARN de entrada. Reducir aún más el volumen puede suponer un desafío para la configuración manual debido a las dificultades de pipeteo. P: ¿Cómo puedo determinar la temperatura de hibridación para mis reacciones LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR? R: Se recomienda encarecidamente el uso de la calculadora NEB Tm para las reacciones LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR, ya que las temperaturas de hibridación óptimas tienden a ser más altas para la ADN polimerasa Q5 Hot Start. Al realizar una RT-PCR multiplex, utilice la temperatura de annealing calculada para el amplicón con la temperatura de annealing más baja. P: ¿Puedo aumentar el tiempo de transcripción inversa más allá de los 10 minutos recomendados en el protocolo LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR? R: El tiempo de RT recomendado de 10 minutos a 55 °C en el protocolo LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR es suficiente para la mayoría de las necesidades de síntesis de ADNc. Aumentar el tiempo de RT hasta 20 minutos puede aumentar el rendimiento del producto cuando la concentración final de cada cebador es inferior a 0,1 µM. P: ¿Son los productos de PCR generados con el kit LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR compatibles con un sistema de clonación TA? R: Los productos de PCR creados por la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 Hot Start contienen extremos romos de ADN y se pueden clonar directamente utilizando el kit de clonación NEB PCR (NEB n.° E1202). Se requiere un paso de cola de dA para un sistema de clonación basado en TA. P: ¿Cuál es la cantidad mínima de ARN recomendada para el kit LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR? R: La amplificación exitosa del gen diana depende de la calidad de las muestras de ARN y de la abundancia de la expresión génica diana. Por ejemplo, se detectó un amplicón GAPDH de 570 pb a partir de tan solo 0,01 pg de ARN humano total de alta calidad. También se generaron bibliotecas NGS exitosas a partir de tan solo 10 copias de ARN sintético de SARS-CoV-2 utilizando el protocolo ARTIC. P: ¿Qué puedo hacer si un amplicón en particular falla en una reacción multiplex con el kit LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR? R: Primero, asegúrese de que la longitud del amplicón esté dentro del rango recomendado de 100 a 1500 pb. Si lo está, pero no se amplifica en una reacción multiplex, realice una RT-PCR de un solo plexo para evaluar el rendimiento de los cebadores. Rediseñe los cebadores siguiendo las directrices de la sección "Consejos y consideraciones generales" del manual si no se obtuvo una amplificación satisfactoria en una RT-PCR de plexo simple. Si el conjunto de cebadores funciona bien en una RT-PCR de plexo simple, aumente su concentración en el pool de cebadores (donde cada cebador normalmente tiene la misma concentración) mediante titulación. Es probable que esto mejore su amplificación en una reacción de RT-PCR multiplex. Además del reequilibrio de la concentración de cebadores individuales, a medida que aumenta el número de dianas en la RT-PCR multiplex, la concentración de cebadores individuales puede disminuir; por lo tanto, aumentar el tiempo de annealing también puede mejorar el rendimiento general de la RT-PCR. Para obtener los mejores resultados, recomendamos determinar empíricamente el tiempo de annealing en función de la concentración de cebadores, con una concentración total final de cebadores entre 1 y 4 µM. P: ¿Puedo usar el kit LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR para amplificar amplicones largos? R: El kit LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR está optimizado para la RT-PCR multiplex dirigida a amplicones de entre 100 y 1500 pb y puede amplificar rutinariamente amplicones de hasta 3 kb en reacciones de plexo simple. Para amplicones largos, elija el kit OneTaq® One-Step RT-PCR (NEB n.° E5315) o la RT-PCR de dos pasos. Para la RT-PCR de dos pasos, utilice la Tabla de selección de síntesis de ADNc para identificar la RT y la ADN polimerasa más adecuadas para su aplicación. P: ¿Se puede utilizar el kit LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR en el flujo de trabajo ARTIC para la secuenciación genómica de ARN viral? R: Sí, este kit puede utilizarse para amplificar genomas virales de ARN con el esquema de RT-PCR multiplexada utilizado en el flujo de trabajo ARTIC. Es posible que se requiera una mayor optimización para lograr un equilibrio uniforme de amplicones y una cobertura genómica uniforme. P: ¿Cómo elijo entre los protocolos de RT-PCR de un solo paso y de dos pasos? R: Tanto los protocolos de RT-PCR de un solo paso como los de dos pasos ofrecen una detección robusta de dianas de ARN. Dependiendo del diseño y los objetivos de su experimento, podría preferir un protocolo. Consulte la siguiente tabla: P: ¿Cómo elijo entre el kit LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR y el kit OneTaq One-Step RT-PCR (NEB n.° E5315)? R: Ambos kits permiten la RT-PCR de un solo paso. Consulte la siguiente tabla como guía para elegir entre el kit LunaScript y el kit OneTaq One-Step RT-PCR (NEB n.° E5315).