New England Biolabs, E1601L, Kit de montaje NEBridge® Golden Gate (BsaI-HF® v2)

Complemente este kit con el kit de ensamblaje Golden Gate de NEBridge (BsmBI-v2) ( Categorías relacionadas Kits de ensamblaje, clonación y mutagénesis de ADN Aplicaciones Ensamblaje y clonación de ADN, Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento, Especificación del ensamblaje Golden Gate de NEBridge® Materiales necesarios pero no suministrados Insertos definidos por el usuario Células competentes Otros materiales para la transformación Agua libre de nucleasas (NEB n.º B1500) Preguntas frecuentes P: ¿Por qué la mezcla de ensamblaje Golden Gate ahora incluye BsaI-HFv2? R: Las investigaciones que utilizan sistemas de prueba de ensamblaje de 12 y 24 fragmentos más desafiantes mostraron la clara superioridad de la enzima BsaI-HFv2 recientemente rediseñada sobre BsaI. Esto es evidente en las eficiencias de ensamblaje (número de transformantes), las precisiones de ensamblaje (fidelidad) y los aumentos continuos en la formación del ensamblaje en números de ciclos más altos de lo habitual si se desea. La mezcla es idéntica a la original excepto por el reemplazo de la enzima de restricción de tipo IIS. P: ¿Cuál es el mecanismo para el ensamblaje Golden Gate? R: El ensamblaje utiliza dos Actividades enzimáticas en una sola reacción: digestión con endonucleasa de restricción tipo IIS y ligación con ADN ligasa T4. Con componentes de tampón y proporciones enzimáticas optimizados, una sola reacción que contiene un plásmido de destino e insertos (amplicones de PCR o preclonados) dará como resultado la ligación de los insertos en el orden correcto y la acumulación del producto ensamblado con el tiempo. El ensamblaje final no presenta ninguno de los sitios de reconocimiento de tipo IIS elegidos, lo que lo vuelve inerte a la digestión posterior. Para más información, consulte nuestro tutorial en línea en www.neb.com/goldengate. P: ¿Qué afecta la eficiencia del ensamblaje Golden Gate? R: La clonación de un solo inserto es significativamente más eficiente que la clonación de múltiples insertos. La eficiencia del ensamblaje disminuye a medida que aumenta el número de fragmentos. La presencia de secuencias repetitivas en un inserto también reduce la eficiencia. Para insertos < 250 pb o > 3 kb, la preclonación aumenta la eficiencia. Por último, las restricciones normales sobre el tamaño total del plásmido que permiten el mantenimiento estable en E. coli se aplican a los ensamblajes Golden Gate. La eficiencia es máxima con construcciones plasmídicas de producto ensamblado. ~ 10-12 kb. Se pueden realizar ensamblajes completos de mayor tamaño, pero se requerirá el cribado de un mayor número de colonias para obtener los productos ensamblados de longitud completa correctos. Para ejemplos experimentales de complejidad vs. eficiencia, consulte la Nota Técnica del Ensamblaje Golden Gate. P: ¿Por qué muchos de los artículos publicados sobre el Ensamblaje Golden Gate presentan insertos preclonados en lugar de insertos generados por PCR? R: Los insertos preclonados permiten un almacenamiento estable de los insertos, mientras que el uso de insertos de amplicones ahorra tiempo. El almacenamiento estable de los insertos de amplicones es importante y se optimiza en una solución tamponada. La clonación/ensamblaje de un solo inserto puede usar amplicones sin purificar, pero el rendimiento será menor que si se purifican, mientras que los amplicones de múltiples insertos deben purificarse, por ejemplo, mediante protocolos de columna de centrifugación. Recomendamos el kit Monarch® PCR and DNA Cleanup (NEB n.° T1030). Para el almacenamiento a largo plazo a –20 °C, almacene el ADN en Tris 10 mM (pH 8,5), EDTA 1 mM (TE) o para el almacenamiento a corto plazo en 10 mM Tris (pH 8,5), 0,1 mM EDTA (TE modificado). El EDTA a estos niveles no reducirá significativamente los 10 mM MgCl2 presentes en el tampón T4 ADN ligasa utilizado para las reacciones de ensamblaje. P: Usar amplicones purificados directamente sin preclonar parece mucho más fácil, pero ¿disminuye la eficiencia del ensamblaje? R: No. Si bien en general el ADN es más estable en forma circular que en forma lineal debido a la ausencia de extremos libres, los amplicones son una forma viable y fácil de construir ensamblajes siempre que se hayan purificado y se almacenen en el tampón adecuado (consulte las preguntas frecuentes). La relación molar 2:1 sugerida de insertos de amplicón: vector de destino lleva la eficiencia del ensamblaje a la de los insertos preclonados (usando 75 ng de cada plásmido) para la mayoría de los ensamblajes. P: ¿Se pueden usar amplicones de PCR directamente en reacciones de ensamblaje sin purificación? R: Sí, siempre que el volumen del inserto sea de 1 µl o menos y se esté realizando un solo inserto (clonación). Aunque la eficiencia disminuirá. La mayoría de las enzimas de restricción de tipo IIS utilizadas para el ensamblaje Golden Gate generan salientes de cuatro bases 5' que pueden ser rellenados por la ADN polimerasa de arrastre utilizada en PCR al utilizar amplicones sin purificar, lo que produce extremos romos. Esto provocará un ensamblaje inespecífico. Para la clonación/ensamblaje de un solo inserto, la ligasa compite con éxito con la ADN polimerasa de arrastre, de modo que se pueden utilizar insertos de amplicones de PCR sin purificar, pero esto resultará en un menor rendimiento del ensamblaje. Para ensamblajes Golden Gate de múltiples insertos, purifique los amplicones y, si hay productos inespecíficos presentes, optimice la PCR o purifique en gel. P: ¿Por qué se utiliza Golden Gate también para la clonación de un solo inserto? R: Si bien Golden Gate se utiliza normalmente para ensamblajes de insertos de 5 a 10 o más fragmentos, también permite la clonación fácil y altamente eficiente de insertos individuales siguiendo las instrucciones proporcionadas. Golden Gate también se puede utilizar con diversas poblaciones de insertos individuales para preparaciones de bibliotecas y evolución dirigida que requieren mutagénesis en múltiples sitios. P: ¿Qué sucede si hay BsaI interna y ¿Sitios BsmBI en mis secuencias de inserto? R: Utilice mutagénesis dirigida para eliminar los sitios internos de antemano, o utilice los sitios internos como uniones entre fragmentos mediante cebadores para introducir las mutaciones silenciosas en la secuencia simultáneamente durante la generación de fragmentos. También puede analizar sus secuencias para detectar la ausencia de otros sitios de restricción de tipo IIS que permitan el uso de una enzima de restricción de tipo IIS alternativa, como BbsI, SapI/BspQI o BtgZI (construyendo sus reacciones de ensamblaje utilizando enzimas de restricción individuales y stocks de ADN ligasa T4), o considere otro método de ensamblaje como NEBuilder® HiFi DNA Assembly si el ensamblaje implica 5 insertos o menos. Consulte nuestro Tutorial de Domesticación de Golden Gate. P: ¿Por qué las reacciones de ensamblaje terminan con un paso de incubación de 5 minutos a 60 °C? R: El paso de incubación final a 60 °C favorece el corte con la enzima de restricción de tipo IIS, en ausencia de ligadura del ADN. La digestión de cualquier plásmido de destino sin cortar o cortado/religado que aún esté presente en las reacciones de ensamblaje reduce el fondo. P: ¿Cómo puedo minimizar? ¿Errores generados por PCR en mis insertos de amplicón? R: Use una ADN polimerasa de alta fidelidad y evite la sobreamplificación. Recomendamos las formulaciones de ADN polimerasa de alta fidelidad Q5® para una fidelidad máxima (NEB #M0491, #M0493), que también están disponibles en formato Master Mix (NEB #M0492, #M0494). Además, use el número mínimo de ciclos necesario para generar la cantidad de ADN necesaria para el ensamblaje; esto suele ser 20 ciclos o menos. P: ¿Se pueden reducir las reacciones de ensamblaje Golden Gate? R: Excepto en reacciones de ensamblaje de múltiples insertos muy complejas, las reacciones se pueden reducir de 2 a 3 veces si el volumen de entrada lo permite. Esto se puede hacer reduciendo el volumen de reacción y los componentes proporcionalmente, o manteniendo el volumen de reacción de 20 µl pero usando de 2 a 3 veces menos de cada componente de ADN. En este último caso, sembrar una mayor cantidad de excrecencia para compensar. P: ¿Puedo usar otras cepas competentes de E. coli que... ¿NEB 10-beta? ¿Puedo usar células de eficiencia de subclonación? R: Sí, se pueden usar otras cepas celulares, pero los ensamblajes grandes requerirán cepas con una estabilidad de plásmidos alta, como E. coli competente NEB 10-beta (alta eficiencia, NEB n.° C3019) o E. coli competente estable NEB (alta eficiencia, NEB n.° C3040). También se recomiendan E. coli competente estable NEB para insertos que contienen elementos repetitivos o inestables. Para ensamblajes más pequeños, también se pueden usar otras cepas como E. coli competente NEB 5-alfa (alta eficiencia, NEB n.° C2987), E. coli competente NEB Turbo (alta eficiencia, NEB n.° C2984) o E. coli competente NEB T7 Express (alta eficiencia, NEB n.° C2566). Las células de eficiencia de subclonación resultarán en niveles de transformación más bajos y no deben usarse para multicomponentes. Ensamblajes. P: ¿Cuál es el control negativo adecuado para el ensamblaje Golden Gate? R: Los protocolos de ensamblaje Golden Gate no suelen requerir un control negativo. Sin embargo, si se desea, se puede utilizar una reacción sin inserción. P: ¿Cuántos ciclos son óptimos? R: Nuestra estabilidad enzimática mejorada permite más ciclos que los 30 ciclos tradicionales si se desea un mayor número de transformantes para ensamblajes complejos o la generación de bibliotecas de insertos individuales. Tanto para nuestro kit de ensamblaje original basado en BsaI-HFv2 como para nuestro kit de ensamblaje basado en BsmBI-v2, la eficiencia aumenta drásticamente de 30 ciclos a 60-65 ciclos, sin pérdida de fidelidad. P: ¿Qué kit de NEB debo usar para el ensamblaje Golden Gate: el kit BsmBI-v2 (NEB n.° E1602) o el kit original BsaI-HFv2 (NEB n.° E1601)? R: Depende de si existen sitios internos para estas enzimas en las secuencias de insertos. Dado que los sitios internos deben eliminarse mediante la técnica dirigida Para la mutagénesis, elija el kit según la enzima de restricción de tipo IIS que no tenga sitios, o que tenga la menor cantidad, en sus secuencias de inserción. Si sus secuencias no tienen sitios BsmBI ni BsaI, el kit BsmBI-v2 (NEB n.° E1602) sería la mejor opción, ya que ofrece el mayor rendimiento de ensamblaje complejo desarrollado hasta la fecha en NEB, tanto en términos de eficiencia (número de transformantes) como de fidelidad (porcentaje de ensamblajes correctos). Sin embargo, ambos kits admiten ensamblajes complejos de 24 fragmentos. También puede usar la mezcla maestra de ligasa NEBridge (NEB n.° M1100), diseñada para usarse con cualquier enzima de restricción de tipo IIS de NEB. P: ¿Cómo puedo acceder a pGGAselect como archivo GenBank o FASTA? R: Visite la herramienta de secuencias y mapas de ADN para obtener archivos de secuencia con formato FASTA o GenBank de pGGAselect y su mapa de plásmidos. P: ¿Interferirá el EDTA con la restricción y ligadura de BsaI? R: No. El tampón Golden Gate de NEB en La concentración 1X contiene 10 mM de MgCl₂. La adición de insertos con 0,1 mM de EDTA no interfiere con el nivel de MgCl₂ requerido por las enzimas. P: ¿Por qué se realiza un paso de calentamiento a 55 °C durante 5 minutos al final de la reacción de ensamblaje? R: El paso final de incubación a 55 °C favorece el corte con BsaI, en ausencia de ligadura del ADN. La digestión de cualquier plásmido aún presente en las reacciones de ensamblaje reduce el fondo. El ensamblaje Golden Gate puede tolerar un sitio interno de BsaI en un fragmento; en este caso, omita el paso de 55 °C y cribe más colonias, ya que el fondo será mayor. P: ¿Cuántos pares de bases deben tener mis insertos de amplicón flanqueando el sitio de restricción de tipo IIS? R: Los insertos de amplicón deben poseer bases flanqueantes en el extremo 5' y sitios de restricción de tipo IIS en ambos extremos del amplicón con la orientación correcta. Recomendamos agregar 6 bases flanqueantes en el extremo 5' de los cebadores para una unión óptima de la enzima de restricción de tipo IIS. Escisión y eficiencia general del ensamblaje Golden Gate. Esta recomendación de 6 pares de bases reemplaza otras preferencias conocidas de longitud de extremo para las enzimas de restricción de tipo IIS, debido a que los protocolos de ensamblaje Golden Gate requieren la máxima actividad enzimática para un ensamblaje eficiente.