New England Biolabs, E1602S, Kit de montaje NEBridge® Golden Gate (BsmBI-v2)

Categorías relacionadas Ensamblaje de ADN, kits de clonación y mutagénesis Aplicaciones Ensamblaje de ADN y clonación,, Soluciones de automatización y clonación de alto rendimiento,, Especificación del ensamblaje Golden Gate de NEBridge® Materiales necesarios pero no suministrados Insertos definidos por el usuario Células competentes Otros materiales para transformación Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es el mecanismo del ensamblaje Golden Gate? R: El ensamblaje utiliza dos actividades enzimáticas simultáneas en una sola reacción, digestión con endonucleasa de restricción tipo IIS y ligación de la ADN ligasa T4. Con componentes de tampón y proporciones enzimáticas optimizados, una sola reacción que contiene un plásmido de destino e insertos (amplicones de PCR o preclonados) dará como resultado la ligación de insertos en el orden correcto y la acumulación del producto ensamblado con el tiempo. El ensamblaje final no tiene ninguno de los sitios de reconocimiento de tipo IIS elegidos, lo que lo vuelve inerte a una digestión posterior. Para obtener más información, consulte nuestro tutorial en línea en www.neb.com/goldengate. P: ¿Qué kit de NEB debería usar para el ensamblaje Golden Gate: el kit BsmBI-v2 (NEB n.° E1602) o el kit BsaI-HFv2 original (NEB n.° E1601)? R: Depende de si existen sitios internos para estas enzimas en sus secuencias de inserción. Dado que los sitios internos deben eliminarse mediante mutagénesis dirigida, elija el kit según la enzima de restricción de tipo IIS que no tenga sitios, o que tenga menos, en sus secuencias de inserción. Si sus secuencias no tienen sitios BsmBI ni BsaI, el kit BsmBI-v2 (NEB n.° E1602) sería la mejor opción, ya que ofrece el mayor rendimiento de ensamblaje complejo desarrollado hasta la fecha en NEB, tanto en términos de eficiencia (número de transformantes) como de fidelidad (porcentaje de ensamblajes correctos). Sin embargo, ambos kits admiten ensamblajes complejos de 24 fragmentos. También puede usar la mezcla maestra de ligasa NEBridge (NEB n.° M1100), diseñada para cualquier enzima de restricción NEB tipo IIS. P: ¿Qué ocurre si hay sitios internos BsaI y BsmBI en mis secuencias de inserto? R: Puede usar mutagénesis dirigida para eliminar los sitios internos de antemano o utilizarlos como uniones entre fragmentos mediante cebadores para introducir las mutaciones silenciosas en la secuencia simultáneamente durante la generación de fragmentos. También puede analizar sus secuencias para detectar la ausencia de otros sitios de restricción tipo IIS que permitan usar una enzima de restricción tipo IIS alternativa, como BbsI, SapI/BspQI o BtgZI (generando sus reacciones de ensamblaje utilizando enzimas de restricción individuales y stocks de ADN ligasa T4), o considerar otro método de ensamblaje, como NEBuilder® HiFi DNA Assembly, si el ensamblaje implica 5 insertos o menos. Consulte nuestro tutorial de domesticación de Golden Gate. P: La enzima de restricción tipo IIS utilizada en este kit es BsmBI-v2. ¿Cómo se compara con el BsmBI o el Esp3I originales? R: Si bien los tres pueden realizar ensamblajes complejos (de 24 fragmentos), el BsmBI-v2 presentó la mayor eficiencia (número de transformantes) y fidelidad (porcentaje de constructos correctamente ensamblados) de los tres. Estos experimentos de comparación utilizaron las temperaturas optimizadas individualmente para cada enzima: 42 °C para BsmBI y BsmBI-v2, y 37 °C para Esp3I. P: ¿Cómo se compara el rendimiento de este kit con los kits caseros creados con enzimas de restricción de tipo IIS y componentes de la ADN ligasa T4 individuales? R: La creación de reacciones de ensamblaje con componentes enzimáticos separados, disponibles en concentraciones adecuadas para la digestión estándar de ADN, está limitada por la necesidad de mantener los niveles de glicerol en las reacciones idealmente al 10 % o menos. Estos kits caseros funcionarán, pero no igualarán la eficiencia y fidelidad logradas con este kit que presenta niveles de enzimas más altos. P: ¿Qué afecta la eficiencia del ensamblaje Golden Gate? R: La clonación de un solo inserto es significativamente más eficiente que la clonación de múltiples insertos. La eficiencia del ensamblaje disminuye a medida que aumenta el número de fragmentos. La presencia de secuencias repetitivas en un inserto también reduce la eficiencia. Para insertos < 250 pb o > 3 kb, la preclonación aumenta la eficiencia. Por último, las restricciones habituales sobre el tamaño total del plásmido que permiten el mantenimiento estable en E. coli se aplican a los ensamblajes Golden Gate. La eficiencia es máxima con construcciones plasmídicas de producto ensamblado de aproximadamente 10-12 kb. Se pueden realizar ensamblajes completos de mayor tamaño, pero se requerirá un mayor número de colonias para el cribado de los productos ensamblados de longitud completa correctos. Para ejemplos experimentales de complejidad vs. eficiencia, consulte la Nota Técnica del Ensamblaje Golden Gate. P: ¿Por qué muchos de los artículos publicados sobre el Ensamblaje Golden Gate presentan insertos preclonados en lugar de insertos generados por PCR? R: Los insertos preclonados permiten un almacenamiento estable de los insertos, mientras que el uso de insertos de amplicón ahorra tiempo. El almacenamiento estable de los insertos de amplicón es importante y se optimiza en una solución tamponada. La clonación/ensamblaje de un solo inserto puede usar amplicones sin purificar, pero su rendimiento será menor que si se purifican. Por otro lado, los amplicones con múltiples insertos deben purificarse, por ejemplo, mediante protocolos de columna de centrifugación. Recomendamos el kit Monarch® PCR and DNA Cleanup (NEB n.° T1030). Para el almacenamiento a largo plazo a –20 °C, almacene el ADN en Tris 10 mM (pH 8,5) y EDTA 1 mM (TE), o para el almacenamiento a corto plazo en Tris 10 mM (pH 8,5) y EDTA 0,1 mM (TE modificado). El EDTA a estas concentraciones no reducirá significativamente los 10 mM de MgCl₂ presentes en el tampón de ADN ligasa T4 utilizado para las reacciones de ensamblaje. P: Usar amplicones purificados directamente sin preclonar parece mucho más sencillo, pero ¿se reduce la eficiencia del ensamblaje? R: No. Aunque en general el ADN es más estable en forma circular que en forma lineal debido a la ausencia de extremos libres, los amplicones son una forma viable y sencilla de construir ensamblajes siempre que se hayan purificado y se almacenen en el tampón adecuado (ver preguntas frecuentes). La proporción molar sugerida de 2:1 de insertos de amplicón: vector de destino lleva la eficiencia del ensamblaje a la de los insertos preclonados (usando 75 ng de cada plásmido) para la mayoría de los ensamblajes. P: ¿Se pueden usar los amplicones de PCR directamente en reacciones de ensamblaje sin purificación? R: Sí, siempre que el volumen del inserto sea de 1 µl o menos y se esté realizando una sola inserción (clonación). Aunque las eficiencias disminuirán. La mayoría de las enzimas de restricción de tipo IIS utilizadas para el ensamblaje Golden Gate generan salientes de 5'-cuatro bases que pueden ser rellenados por la ADN polimerasa de arrastre utilizada en PCR cuando se utilizan amplicones sin purificar, produciendo extremos romos. Esto conducirá a un ensamblaje inespecífico. Para la clonación/ensamblaje de un solo inserto, la ligasa compite con éxito con la ADN polimerasa de arrastre, de modo que se pueden utilizar insertos de amplicón de PCR sin purificar, pero esto resultará en un menor rendimiento del ensamblaje. Para ensamblajes Golden Gate de múltiples insertos, purifique los amplicones y, si hay productos inespecíficos, optimice la PCR o purifique en gel. P: ¿Por qué se utiliza Golden Gate también para la clonación de un solo inserto? R: Si bien Golden Gate se utiliza normalmente para ensamblajes de insertos de 5 a 10 fragmentos o más, también permite la clonación fácil y altamente eficiente de insertos individuales siguiendo las instrucciones proporcionadas. Golden Gate también se puede utilizar con diversas poblaciones de insertos individuales para la preparación de bibliotecas y la evolución dirigida que requiere mutagénesis en múltiples sitios. P: ¿Por qué las reacciones de ensamblaje finalizan con un paso de incubación de 5 minutos a 60 °C? R: El paso de incubación final a 60 °C favorece el corte con enzimas de restricción de tipo IIS, en ausencia de ligadura de ADN. La digestión de cualquier plásmido de destino sin cortar o cortado/religado aún presente en las reacciones de ensamblaje reduce el ruido de fondo. P: ¿Cómo puedo minimizar los errores generados por PCR en mis insertos de amplicón? R: Utilice una ADN polimerasa de alta fidelidad y evite la sobreamplificación. Recomendamos las formulaciones de ADN polimerasa de alta fidelidad Q5® para una fidelidad máxima (NEB #M0491, #M0493), que también está disponible en formato Master Mix (NEB #M0492, #M0494). Además, utilice el número mínimo de ciclos necesario para generar la cantidad de ADN necesaria para el ensamblaje; este suele ser de 20 ciclos o menos. P: ¿Cuál es un control negativo adecuado para el ensamblaje Golden Gate? R: Los protocolos de ensamblaje Golden Gate no suelen requerir un control negativo. Sin embargo, si se desea, se puede utilizar una reacción de "sin inserto(s) añadido(s)". P: ¿Cuántos ciclos son óptimos? R: Nuestra estabilidad enzimática mejorada permite más ciclos que los 30 ciclos tradicionales si se desea un mayor número de transformantes para ensamblajes complejos o la generación de bibliotecas de insertos individuales. Tanto para nuestro kit de ensamblaje original basado en BsaI-HFv2 como para nuestro kit de ensamblaje basado en BsmBI-v2, la eficiencia aumenta drásticamente de 30 ciclos a 60-65 ciclos, sin pérdida de fidelidad. P: ¿Puedo usar otras cepas de E. coli competentes además de NEB 10-beta? ¿Puedo usar células con eficiencia de subclonación? R: Sí, se pueden usar otras cepas celulares, pero los ensamblajes grandes requerirán cepas que se sepa que mantienen una gran estabilidad de plásmidos, como E. coli competente para NEB 10-beta (alta eficiencia, NEB n.° C3019) o E. coli competente estable para NEB (alta eficiencia, NEB n.° C3040). También se recomiendan las E. coli competentes estables para insertos que contienen elementos repetitivos o inestables. Para ensamblajes más pequeños, también se pueden usar otras cepas como NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C2987), NEB Turbo Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C2984) o NEB T7 Express Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C2566). Las células de subclonación eficiente darán como resultado niveles de transformación más bajos y no deben usarse para ensamblajes multicomponente. P: ¿Cómo puedo acceder a pGGAselect como un archivo GenBank o FASTA? R: Visite la herramienta de secuencias y mapas de ADN para obtener los archivos de secuencia con formato FASTA o GenBank de pGGAselect y su mapa de plásmidos. P: ¿Cuántos pares de bases deben tener mis insertos de amplicón flanqueando el sitio de restricción de tipo IIS? R: Los insertos de amplicón deben poseer bases flanqueantes 5' y sitios de restricción de tipo IIS en ambos extremos del amplicón con la orientación correcta. Recomendamos añadir 6 bases flanqueantes en los extremos 5' de los cebadores para optimizar la unión de la enzima de restricción Tipo IIS, la escisión y la eficiencia general del ensamblaje Golden Gate. Esta recomendación de 6 pares de bases reemplaza otras preferencias conocidas de longitud de extremo para las enzimas de restricción Tipo IIS, debido a que los protocolos de ensamblaje Golden Gate requieren la máxima actividad enzimática para un ensamblaje eficiente.