Kit RCA phi29-XT, E1603S, New England Biolabs

Categorías relacionadas: Aplicaciones de amplificación isotérmica y desplazamiento de cadena. Preguntas frecuentes sobre amplificación isotérmica. P: ¿Cuál es la ventaja de usar la ADN polimerasa phi29-XT en lugar de la phi29 silvestre? R: Generalmente, la ADN polimerasa phi29-XT, en condiciones óptimas, genera más producto en menos tiempo que la enzima silvestre. Además, la phi29-XT es más sensible que la phi29 silvestre, lo que la hace ideal cuando la cantidad de ADN de entrada es extremadamente baja (es decir, femtogramos de ADN circular). Estas cualidades hacen de la phi29-XT la opción ideal para la mayoría de las aplicaciones de RCA. phi29 de tipo salvaje phi29-XT Rápido (3-12 kb/min) ✓ ✓ Altamente procesivo ✓ ✓ Alta fidelidad ✓ ✓ Desplazamiento de cadena ✓ ✓ Temperatura óptima 30 °C 42 °C Rendimiento ✓ ✓✓ Sensibilidad ✓ ✓✓ P: ¿Cómo puedo aumentar el rendimiento de RCA? R: Se puede obtener un mayor rendimiento del producto RCA aumentando el tiempo de incubación o la cantidad de ADN de entrada. Tenga en cuenta que aumentar el tiempo de incubación puede conducir a una mayor amplificación de productos inespecíficos en ausencia de molde. P: ¿En qué rango de temperatura se puede utilizar el kit phi29-XT RCA? R: El rango óptimo de temperatura de reacción es de 40 a 42 °C. No se recomienda la amplificación con este kit a temperaturas inferiores a 37 °C. P: ¿Se puede usar el kit phi29-XT RCA para generar ADN monocatenario? R: Sí, se puede generar ADN monocatenario largo reemplazando los cebadores aleatorios resistentes a exonucleasas por uno o más cebadores unidireccionales (concentración final de 0,2-1 µM). P: ¿Se puede usar el kit phi29-XT RCA para amplificar construcciones de ADN circulares grandes, como BAC y fósmidos? R: Sí, el kit phi29-XT RCA se puede usar para amplificar construcciones de ADN circulares grandes. Si se utiliza ADN de BAC o fósmido purificado como material de partida, siga el protocolo del manual: phi29-XT RCA con entrada de ADN circular purificado. Para la amplificación de ADN de BAC o fósmido directamente de una colonia bacteriana, siga el protocolo de la Sección II con las siguientes modificaciones: Desnaturalización del ADN: resuspenda una sola colonia en 5 µL de tampón de desnaturalización (60 mM KOH, 2 mM EDTA) y lise las células/desnaturalice el ADN a 60 °C durante 10 minutos. Coloque inmediatamente en hielo. Neutralice el ADN desnaturalizado con 5 µL de tampón de neutralización (75 mM, Tris-HCl, pH 7,0). Para mejorar la especificidad de la amplificación de ADN de BAC/fósmido, se recomienda encarecidamente el uso de pares de cebadores específicos de sitio resistentes a la exonucleasa (0,2-1 µM) para reemplazar los cebadores aleatorios. Aumente el tiempo de RCA a 4-8 horas. P: ¿El molde de ADN de entrada debe ser circular? R: La amplificación por círculo rodante requiere ADN molde circular. Sin embargo, los cebadores aleatorios incluidos en este kit también pueden annealing al ADN lineal, y phi29-XT amplificará el ADN lineal a través de un mecanismo de Amplificación de Desplazamiento Múltiple (MDA). P: ¿Cómo puedo verificar la amplificación exitosa y la especificidad de mi reacción RCA? R: La calidad y especificidad del producto RCA se pueden evaluar mediante la digestión con una enzima de restricción y el procesamiento de los productos digeridos en un gel de agarosa junto a una escalera de ADN como Quick-Load® Purple 1 kb Plus DNA Ladder (NEB #N0550). Los productos RCA digeridos deben mostrar los mismos tamaños de fragmento esperados para la plantilla de ADN plasmídico digerido. P: ¿Cómo puedo desramificar mis productos RCA? R: Consulte el manual para obtener instrucciones generales de desramificación. P: ¿Necesito purificar los productos RCA antes de las aplicaciones posteriores? R: Muchas aplicaciones posteriores solo requieren la dilución de los productos RCA antes de su uso. Si es necesaria la purificación, los productos RCA pueden limpiarse con microesferas SPRI® 0.6X, siguiendo las recomendaciones del fabricante. P: ¿Cómo cuantifico mis productos RCA? R: Los productos RCA pueden cuantificarse directamente con el kit de ensayo Quant-iT® PicoGreen® dsDNA o con un fluorómetro Qubit® tras diluirlos al rango de detección adecuado. Como alternativa, los productos RCA purificados pueden cuantificarse midiendo la absorbancia a 260 nm o con NanoDrop®. P: ¿Se puede inactivar térmicamente la ADN polimerasa phi29-XT? R: Sí, la phi29-XT puede inactivarse térmicamente mediante incubación a 65 °C durante 10 minutos. P: ¿Puedo usar este kit para incorporar 5-metil-dCTP? R: Sí, el kit phi29-XT RCA permite incorporar 5-metil-dCTP reemplazando hasta el 100 % del dCTP con 5-metil-dCTP (NEB n.° N0356). P: ¿Funciona la ADN polimerasa phi29-XT en el tampón de reacción de la ADN polimerasa phi29 de tipo silvestre? R: Sí, la phi29-XT amplifica en el tampón de reacción de la ADN polimerasa phi29 de tipo silvestre 1X (NEB n.° B0269). Sin embargo, el rendimiento suele ser menor en comparación con la síntesis en el tampón de reacción phi29-XT 1X (NEB n.° B0572). P: ¿Se puede utilizar la ADN polimerasa phi29-XT en las condiciones de reacción de la phi29 RCA de tipo silvestre (tampón de reacción de la ADN polimerasa phi29 1X a 30 °C)? R: Sí, la ADN polimerasa phi29-XT funcionará en las condiciones de reacción de la phi29 de tipo silvestre y generará un rendimiento comparable al de la enzima de tipo silvestre en estas condiciones. Sin embargo, para la ADN polimerasa phi29-XT, se esperan mayores rendimientos al realizar la reacción a 42 °C. P: Uso de cebadores específicos para RCA con phi29-XT R: Según observaciones limitadas, los cebadores de 13-16 bases son más eficientes que los cebadores más largos. Como regla general de diseño de cebadores (RCA, PCR, etc.), intente evitar más de 3 G o C en las últimas cinco bases para evitar un cebado incorrecto. Es fundamental que el extremo 3' esté protegido de la fuerte actividad exonucleasa de phi29 mediante la inclusión de enlaces fosforotioato 2-3. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit phi29-XT WGA (NEB #E1604) y el kit phi29-XT RCA (NEB #E1603)? R: La ADN polimerasa phi29-XT es eficaz para amplificar ADN circular mediante Amplificación por Círculo Rodante (RCA), así como ADN genómico mediante Amplificación por Desplazamiento Múltiple (MDA). Sin embargo, la polimerasa phi29-XT incluida en el kit phi29-XT WGA (NEB #E1604) ha sido formulada para reducir el sesgo de GC durante la amplificación de ADN genómico humano. Para la RCA, recomendamos utilizar el kit phi29-XT RCA (NEB #E1603).