Product Description
Categorías relacionadas con Epimark Enriquecimiento, Análisis del epitranscriptoma, Análisis del metiloma, Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Tampón de reacción (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 % NP-40 en H2O libre de nucleasas) Perlas magnéticas de proteína G (NEB n.º S1430) Gradillas magnéticas para separación de perlas (NEB n.º S1506 o n.º S1509) Kit de limpieza de ARN Monarch ® (10 µg) (NEB n.º T2030) 100 % etanol 70 % etanol Tubos de microcentrífuga Eppendorf ® ARN/ADN LoBind (catálogo Sigma n.º Z666548) o equivalente Puntas de pipeta libres de ARNasa Guantes sin polvo Agua libre de nucleasas Materiales opcionales Cebadores para la amplificación de ARN de control: Cebador directo GLuc = 5´- CGACATTCCTGAGATTCCTGG - 3´ Cebador inverso GLuc = 5´- TTGAGCAGGTCAGAACACTG - 3´ Cebador directo CLuc = 5´- GCTTCAACATCACCGTCATTG - 3´ Cebador inverso CLuc = 5´- CACAGAGGCCAGAGATCATTC - 3´ ProtoScript ® II First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB n.º E6560) Bio-Rad iTaq™ Universal SYBR ® Green Supermix (n.º de cat. 172-5120) Placa de PCR de 384 pocillos (Bio-Rad n.º de cat. HSP-3805) Película óptica (Bio-Rad n.º de cat. MSB-1001) Preguntas frecuentes P: ¿Qué cantidad de ARN de control debo usar si quiero añadirlos a mi muestra? R: Si pretende añadir los ARN de control a su muestra, es esencial usar una cantidad mucho menor que cuando se realiza una IP de control solo en ellos. Esto se debe a que el ARN de control m6A está altamente modificado y el anticuerpo tiene una alta afinidad por él. Esto dará como resultado que el ARN de control m6A se vuelva predominante en la muestra después de la IP. Se recomienda el uso de 1 µl de una dilución 1:1000 de cada ARN de control (0,1 fmol de cada ARN). Los ARN de control se pueden añadir antes o después de la fragmentación de la muestra de ARN. Si se añaden después, se debe fragmentar y diluir una reserva concentrada de los ARN de control antes de añadirla a la muestra. P: ¿Se unirá el anticuerpo al ADN que contiene m6A? R: El anticuerpo no se ha probado mucho en sustratos de ADN, pero es muy probable que funcione bien en ADN monocatenario que contiene m6A. Es posible que también se una a ADN bicatenario que contiene m6A, pero la afinidad podría ser significativamente menor que la de los sustratos monocatenarios. P: ¿Cuál es la concentración proteica del anticuerpo N6-metiladenosina? R: El anticuerpo se formula en función de la actividad y la concentración puede ajustarse entre lotes para obtener resultados óptimos. El kit contiene 20 µl de anticuerpo, suficientes para 10 inmunoprecipitaciones de 2 rondas. P: No obtuve suficiente rendimiento de ARN para mi aplicación posterior después de dos rondas de IP. ¿Cómo puedo aumentar el rendimiento? R: Una forma de aumentar la recuperación de ARN es realizar una ronda de IP en lugar de dos. Una ronda suele generar suficiente enriquecimiento de ARN que contiene m6A. Alternativamente, la IP se puede realizar con 2, 3 o 4 µl de anticuerpo por ronda para 1 o 2 rondas. El uso de anticuerpo adicional dará como resultado que se recupere más ARN y la cantidad de enriquecimiento seguirá siendo significativa. Sin embargo, el uso de >4 µl de anticuerpo podría reducir el enriquecimiento, ya que también se recuperará una cantidad significativa de ARN sin modificar. P: ¿Qué método recomiendan para la fragmentación del ARN? R: Recomendamos utilizar el módulo de fragmentación de ARN de magnesio NEBNext® (catálogo NEB n.° E6150S) para este fin. Sin embargo, cualquier protocolo de fragmentación de ARN establecido funcionará siempre que produzca ARN compatible con la aplicación posterior al enriquecimiento. Se recomienda limpiar el ARN mediante columnas de centrifugación o extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol después de la fragmentación.
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