Kit de lámpara WarmStart® (ADN y ARN) E1700L de New England Biolabs

¿Necesita ayuda para diseñar cebadores LAMP? Utilice las categorías relacionadas Amplificación isotérmica y aplicaciones de desplazamiento de hebra Amplificación isotérmica mediada por bucle, Especificación de amplificación isotérmica Materiales necesarios pero no suministrados Cebadores LAMP (recomendamos utilizar la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP) Muestras de ácidos nucleicos diana H₂O de grado de biología molecular Bloque térmico, baño de agua, turbidímetro o termociclador en tiempo real (con medición de fluorescencia en tiempo real si se desea) y recipientes de reacción apropiados para el instrumento Preguntas frecuentes P: ¿Qué componentes se incluyen en el kit WarmStart LAMP (ADN y ARN)? R: El kit incluye una mezcla maestra 2X que contiene un tampón de reacción con todos los cofactores necesarios a concentraciones optimizadas para ensayos LAMP y RT-LAMP: dNTP, MgSO₄, ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart® y WarmStart RTx. El kit también contiene un tubo de colorante fluorescente LAMP 50X que se une al dsADN para la detección de LAMP en tiempo real. Para realizar una reacción LAMP, el usuario añade cebadores, ADN o ARN diana y ajusta la mezcla maestra a una concentración final de 1X. Puede encontrar instrucciones detalladas en el manual del kit. P: ¿Cuál es la temperatura óptima de amplificación LAMP/RT-LAMP? R: Recomendamos 65 °C como temperatura inicial de LAMP. Sin embargo, es posible realizar reacciones LAMP y RT-LAMP a 55-70 °C, dependiendo de la naturaleza del conjunto de cebadores y las dianas. P: ¿Cuál es la concentración de Mg++ en la mezcla maestra WarmStart LAMP/RT-LAMP? R: La mezcla maestra 2X contiene 16 mM de MgSO4 y, por lo tanto, 8 mM de MgSO4 en la reacción final 1X. P: ¿Cómo se utiliza el colorante fluorescente? R: El colorante fluorescente se puede detectar utilizando el canal SYBR®/FAM de los instrumentos comunes de PCR en tiempo real. El colorante fluorescente intercalante se proporciona a una concentración de 50X y sugerimos usar 0,5 μl de colorante por cada 25 μl de reacción LAMP para monitorizar la amplificación en la mayoría de los instrumentos de qPCR en tiempo real. En algunas situaciones, puede ser necesaria una mayor dilución del colorante (hasta una concentración final de 0,1-0,5X). P: ¿Qué tipos de muestras/materiales de entrada son compatibles con las mezclas LAMP/RT-LAMP? R: LAMP suele ser una técnica robusta y tolerante a inhibidores, y la mezcla maestra WarmStart® LAMP/RT-LAMP puede realizar la amplificación directa utilizando diversos tipos de muestras. Para obtener la máxima especificidad y sensibilidad, recomendamos ácido nucleico purificado como entrada. La mayoría de los métodos rutinarios de purificación de plantillas son suficientes, como los kits de extracción de ácidos nucleicos Monarch®. Sugerimos usar 2 µl de ácido nucleico extraído para una reacción LAMP de 25 µl. Se pueden tolerar volúmenes de muestra mayores o menores. Las muestras en medios de transporte (VTM o UTM) deben mantenerse a menos de 2 µl (8 % v/v). P: ¿Con qué rapidez puedo obtener el resultado? R: La amplificación de la diana varía según diversos factores, como el diseño del cebador (recomendamos usar la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP), la pureza y la cantidad de la plantilla. Sugerimos comenzar con un tiempo de incubación de 30 minutos. Si se desea, el tiempo se puede acortar a 15-20 minutos con ensayos optimizados o dianas con un alto número de copias. Como alternativa, se puede prolongar hasta 60 minutos para entradas bajas, muestras impuras o ensayos más lentos. Tenga en cuenta que al extender el tiempo de reacción, también se deben monitorizar los NTC para evitar falsos positivos. P: ¿Cómo confirmo un resultado positivo? R: Las reacciones LAMP producen una serie de concatémeros que contienen la secuencia diana y que varían en tamaño. Dado que los amplicones LAMP contienen repeticiones de la misma secuencia de ADN, suelen tener una temperatura de fusión única que puede confirmar la amplificación de la diana correcta. Si se utiliza fluorescencia en tiempo real, se puede incluir una curva de fusión o desnaturalización después de la incubación con LAMP. Para obtener más información, consulte la sección "Solución de problemas" del manual del kit WarmStart LAMP. P: ¿Puedo preparar mis reacciones LAMP/RT-LAMP a temperatura ambiente? R: Sí, las enzimas ADN polimerasa Bst y transcriptasa inversa utilizadas en esta mezcla maestra son formulaciones WarmStart®, por lo que se inhiben con aptámeros modificados a temperatura ambiente. Por lo tanto, las reacciones se pueden preparar a temperatura ambiente sin afectar significativamente la actividad de LAMP. Para obtener más información sobre la modulación de la actividad enzimática a temperatura ambiente con aptámeros, consulte "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas: Hot Start Taq y más allá". P: ¿Puedo usar dUTP y UDG para prevenir la contaminación por arrastre con la mezcla maestra WarmStart LAMP? R: Sí, la mezcla maestra WarmStart LAMP es compatible con la prevención de contaminación por arrastre de dUTP/UDG. La mezcla maestra NEB n.° m1700 no contiene dUTP, pero se pueden añadir 700 μM de dUTP (NEB n.° N0459) a la mezcla sin afectar significativamente el rendimiento de LAMP. Es importante utilizar UDG termolábil antártico (NEB n.° M0372), ya que la temperatura isotérmica (65 °C) de la reacción LAMP es insuficiente para inactivar el UDG de E. coli, y el uso de la forma de E. coli puede inhibir LAMP. Simplemente añada 0,02 U/μL de UDG termolábil antártico y prepare las reacciones a temperatura ambiente para destruir los productos LAMP contaminantes. Actualmente, existe una versión de la mezcla maestra LAMP formulada con dUTP y UDG termolábil como producto independiente (NEB n.° M1708) o como kit con colorante fluorescente (NEB n.° E1708). P: La mezcla maestra WarmStart LAMP presenta algo de precipitación en el tubo después de la descongelación. ¿Es normal? R: Sí, la precipitación de las mezclas maestras LAMP tras la congelación/descongelación es normal. Es importante resuspender la mezcla mezclándola bien o agitándola en vórtex para disolver todo el precipitado, pero después de la suspensión, las mezclas maestras pueden utilizarse con normalidad. P: ¿Cómo se diseñan los cebadores LAMP? R: Diseñar manualmente los cebadores LAMP puede ser complicado, por lo que se recomienda encarecidamente el uso de programas informáticos tanto para facilitar el diseño como para garantizar el éxito de la reacción. Recomendamos utilizar la herramienta de diseño de cebadores LAMP de NEB. Dado que el rendimiento y los niveles de amplificación sin molde pueden variar incluso con el diseño in silico, recomendamos evaluar de 2 a 4 conjuntos completos de cebadores LAMP para obtener una sensibilidad y especificidad óptimas antes de elegir el conjunto definitivo. Para obtener una visión general del diseño y la utilización de los cebadores LAMP, consulte nuestro tutorial sobre la herramienta de diseño de cebadores LAMP y lea esta nota de aplicación para obtener más información. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit NEB n.° E1708: WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (con UDG) y el NEB n.° E1700: WarmStart LAMP Kit (ADN y ARN)? R: Ambos kits LAMP incluyen una mezcla maestra 2X con Bst 2.0 WarmStart® y WarmStart RTx para la amplificación de dianas de ARN y ADN/ADNc, y un colorante fluorescente LAMP 50X que se une al dsADN para la detección en tiempo real. El kit WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (con UDG) contiene una mezcla maestra formulada con dUTP y UDG termolábil antártico (NEB n.° M0372), lo que evita la amplificación de productos de reacciones anteriores que contienen uracilo. Estas adiciones reducen la posibilidad de contaminación por arrastre (donde el producto de una reacción anterior puede servir inesperadamente como sustrato de una reacción posterior). P: Se produjo una amplificación en mis muestras de NTC tras la incubación isotérmica. ¿Qué sucedió? R: La amplificación en el control sin molde dentro de los 30 minutos puede indicar contaminación cruzada durante la configuración de la reacción o un problema sistémico. Algunos conjuntos de cebadores son más susceptibles a la amplificación inespecífica que otros. Recomendamos evaluar al menos dos conjuntos de cebadores LAMP para cualquier diana dada. Además, algunos formatos de reacción o flujos de trabajo pueden ser más propensos a la amplificación inespecífica con conjuntos de cebadores particulares como: Grandes volúmenes de reacción en recipientes pequeños (p. ej., 20 µL en placas de 384 pocillos) Bajas temperaturas de reacción (p. ej., 60 °C en lugar de 65 °C) Si se utiliza un termociclador en tiempo real, se puede incluir una curva de fusión o desnaturalización después de la incubación LAMP para distinguir entre la amplificación espuria y la contaminación cruzada, ya que cada amplicón LAMP producirá un perfil de fusión único. Si la reacción NTC es positiva tras repetir la prueba o modificar el flujo de trabajo, reemplace todos los reactivos y limpie el área de trabajo con un descontaminante de superficies adecuado, como lejía al 10 % (dilución 1:10 de hipoclorito de sodio comercial al 5,25-6,0 %). P: ¿Qué métodos de detección se pueden utilizar para los experimentos LAMP/RT-LAMP? R: La mezcla maestra LAMP es compatible con diversas opciones de visualización/detección, como turbidez, fluorescencia, colorimetría no basada en el pH (p. ej., azul de hidroxinaftol) y métodos basados ​​en gel. Los kits LAMP (NEB n.° E1700 y NEB n.° E1708) incluyen un colorante fluorescente LAMP 50X que se une al dsADN para la detección de fluorescencia en tiempo real. P: ¿Se requiere un paso de incubación independiente para RT-LAMP? R: No se requiere un paso de transcripción inversa independiente para realizar la RT-LAMP, ya que la transcriptasa inversa WarmStart RTx produce ADNc durante la incubación isotérmica a 65 °C. P: ¿Dispone NEB de una mezcla maestra para reacciones LAMP o RT-LAMP? R: Sí. Ofrecemos varias opciones compatibles con los protocolos LAMP/RT-LAMP. El kit WarmStart® LAMP (ADN y ARN) (NEB n.° E1700) incluye un colorante fluorescente LAMP 50X para la detección fluorescente de reacciones LAMP/RT-LAMP. La mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X (ADN y ARN) (NEB n.° M1800) incluye un indicador colorimétrico basado en pH para la detección visual de reacciones LAMP/RT-LAMP (un cambio de color de rosa a amarillo indica amplificación). Las versiones actualizadas de ambos productos incluyen UDG termolábil y dUTP para reducir el riesgo de contaminación por arrastre (NEB n.° E1708 y NEB n.° M1804, respectivamente). Además, la mezcla maestra multiusos WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) (NEB n.° M1708) es compatible con diferentes tipos de entrada de muestras y admite múltiples métodos de detección, incluido el azul de hidroxinaftol. Todas las mezclas maestras LAMP incluyen una combinación de transcriptasa inversa WarmStart RTx y ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart para una amplificación rápida y robusta de dianas de ADN y ARN. Cada mezcla requiere únicamente cebadores LAMP proporcionados por el usuario y muestras de ADN o ARN diana. P: ¿Qué son LAMP y RT-LAMP? R: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin necesidad de equipos sofisticados. Utiliza una ADN polimerasa con desplazamiento de soporte, como la ADN polimerasa Bst, y de 4 a 6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas del ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP ofrece alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) con resultados rápidos: las reacciones se pueden realizar en tan solo 5-10 minutos. Las reacciones se pueden realizar con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con medición en tiempo real e instrumentos de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, con RT-LAMP como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB #M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad de RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de la aplicación LAMP. P: ¿Qué tipo de purificación se recomienda para los cebadores LAMP? R: Al cribar varios conjuntos de cebadores LAMP para identificar los que ofrecen un rendimiento óptimo para una diana determinada, la desalinización estándar suele ser suficiente. Sin embargo, recomendamos la purificación mediante PAGE o HPLC de los cebadores FIP y BIP como mínimo para el ensayo final para garantizar la solidez con respecto al tiempo de detección y la sensibilidad.