New England Biolabs, E1708S, Kit de lámpara fluorescente WarmStart®/RT-LAMP (con UDG)

Categorías relacionadas Amplificación isotérmica y aplicaciones de desplazamiento de hebra Amplificación isotérmica mediada por bucle Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Cebadores LAMP (recomendamos usar la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP) Muestras de ácidos nucleicos diana H2O de grado de biología molecular Bloque térmico, baño de agua, turbidímetro o termociclador en tiempo real (con medición de fluorescencia en tiempo real si se desea) y recipientes de reacción apropiados para el instrumento Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la temperatura óptima de amplificación LAMP/RT-LAMP? R: Recomendamos 65 °C como temperatura inicial de LAMP. Sin embargo, es posible realizar reacciones LAMP y RT-LAMP de 55 a 70 °C, dependiendo de la naturaleza del conjunto de cebadores y los objetivos. P: ¿Cuál es la concentración de Mg++ en la mezcla maestra WarmStart LAMP/RT-LAMP? R: La mezcla maestra 2X contiene 16 mM de MgSO4 y, por lo tanto, 8 mM de MgSO4 en la reacción final 1X. P: ¿Cómo se usa el colorante fluorescente? R: El colorante fluorescente se puede detectar mediante el canal SYBR®/FAM de los instrumentos comunes de PCR en tiempo real. El colorante fluorescente intercalante se proporciona a una concentración de 50X y sugerimos usar 0,5 μl de colorante por cada 25 μl de reacción LAMP para monitorizar la amplificación en la mayoría de los instrumentos de qPCR en tiempo real. En algunas situaciones, puede ser necesaria una mayor dilución del colorante (hasta una concentración final de 0,1-0,5X). P: ¿Qué tipos de muestras/materiales de entrada son compatibles con las mezclas LAMP/RT-LAMP? R: LAMP suele ser una técnica robusta y tolerante a inhibidores, y la mezcla maestra WarmStart® LAMP/RT-LAMP permite la amplificación directa con diversos tipos de muestras. Para obtener la máxima especificidad y sensibilidad, recomendamos ácido nucleico purificado como entrada. La mayoría de los métodos rutinarios de purificación de plantillas son suficientes, como los kits de extracción de ácidos nucleicos Monarch®. Sugerimos usar 2 µl de ácido nucleico extraído para una reacción LAMP de 25 µl. Se pueden tolerar volúmenes de muestra mayores o menores. Las muestras en medios de transporte (VTM o UTM) deben mantenerse a menos de 2 µl (8 % v/v). P: ¿Qué tan rápido debo esperar un resultado? R: La amplificación del objetivo variará dependiendo de varios factores, incluyendo el diseño del cebador (recomendamos usar la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP), la pureza y la cantidad de la plantilla. Sugerimos comenzar con un tiempo de incubación de 30 minutos. Si se desea, el tiempo puede acortarse a 15-20 minutos con ensayos optimizados o objetivos con alto número de copias. Alternativamente, puede extenderse hasta 60 minutos para entradas bajas, muestras impuras o ensayos más lentos. Tenga en cuenta que al extender el tiempo de reacción, también deben monitorearse los NTC para asegurar que no haya falsos positivos. P: ¿Cómo confirmo un resultado positivo? R: Las reacciones LAMP producen una serie de concatémeros que contienen la secuencia diana y que varían en tamaño. Dado que los amplicones LAMP contienen repeticiones de la misma secuencia de ADN, suelen tener una temperatura de fusión única que puede confirmar la amplificación de la diana correcta. Si se utiliza fluorescencia en tiempo real, se puede incluir una curva de fusión o desnaturalización después de la incubación con LAMP. Para más información, consulte la sección "Solución de problemas" del manual del kit WarmStart LAMP. P: ¿Puedo preparar mis reacciones LAMP/RT-LAMP a temperatura ambiente? R: Sí, las enzimas Bst ADN polimerasa y transcriptasa inversa utilizadas en esta mezcla maestra son formulaciones WarmStart®, por lo que son inhibidas por aptámeros modificados a temperatura ambiente. Por lo tanto, las reacciones pueden prepararse a temperatura ambiente sin afectar significativamente la actividad LAMP. Para obtener más información sobre la modulación de la actividad enzimática a temperatura ambiente con aptámeros, consulte "Uso de aptámeros para controlar la actividad enzimática: Hot Start Taq y más allá". P: La mezcla maestra WarmStart LAMP presenta algo de precipitación en el tubo después de la descongelación. ¿Es normal? R: Sí, la precipitación de las mezclas maestras LAMP tras la congelación/descongelación es normal. Es importante resuspender la mezcla mezclándola bien o agitándola en vórtex para disolver todo el precipitado, pero después de la suspensión, las mezclas maestras pueden utilizarse con normalidad. P: ¿Cómo se diseñan los cebadores LAMP? R: Diseñar manualmente los cebadores LAMP puede ser complicado, por lo que se recomienda encarecidamente el uso de programas informáticos tanto para facilitar el diseño como para garantizar el éxito de la reacción. Recomendamos utilizar la herramienta de diseño de cebadores LAMP de NEB. Dado que el rendimiento y los niveles de amplificación sin molde pueden variar incluso con el diseño in silico, recomendamos evaluar de 2 a 4 conjuntos completos de cebadores LAMP para obtener una sensibilidad y especificidad óptimas antes de elegir el conjunto definitivo. Para obtener una visión general del diseño y la utilización de los cebadores LAMP, consulte nuestro tutorial sobre la herramienta de diseño de cebadores LAMP y lea esta nota de aplicación para obtener más información. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit LAMP/RT-LAMP fluorescente WarmStart (con UDG) NEB n.° E1708 y el kit LAMP WarmStart (ADN y ARN) NEB n.° E1700? R: Ambos kits LAMP incluyen una mezcla maestra 2X con Bst 2.0 WarmStart® y WarmStart RTx para la amplificación de dianas de ARN y ADN/ADNc, y un colorante fluorescente LAMP 50X que se une al ADN bicatenario para la detección en tiempo real. El kit LAMP/RT-LAMP fluorescente WarmStart (con UDG) contiene una mezcla maestra formulada con dUTP y UDG termolábil antártico (NEB n.° M0372), lo que evita la amplificación de productos de reacciones anteriores que contienen uracilo. Estas adiciones reducen la posibilidad de contaminación por arrastre (donde el producto de una reacción previa puede servir inesperadamente como sustrato de una reacción posterior). P: ¿Qué componentes incluye el kit WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP (con UDG)? R: El kit incluye una mezcla maestra 2X que contiene un tampón de reacción con todos los cofactores necesarios en concentraciones 2X optimizadas para ensayos LAMP: dNTP, MgSO₄, ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart®, WarmStart RTx, ADN glicosilasa de uracilo termolábil antártico (UDG) y dTTP/dUTP. El kit también contiene un colorante fluorescente LAMP 50X que se une al ADN bicatenario para la detección de LAMP en tiempo real. Para realizar una reacción LAMP, el usuario añade cebadores, ADN o ARN diana y ajusta la mezcla maestra a una concentración final de 1X. Encontrará instrucciones detalladas en el manual del kit. P: ¿La mezcla maestra WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) permite prevenir la contaminación cruzada/reducir la contaminación? R: Sí, la mezcla maestra WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) está formulada con una mezcla de dTTP y dUTP. Esto garantiza una amplificación isotérmica eficiente y la incorporación de dU en los productos de reacción. La mezcla también contiene UDG termolábil antártico (NEB n.° M0372). Los productos LAMP que contienen dU sirven como sustrato para la uracilo ADN glicosilasa, lo que permite prevenir la contaminación por arrastre. Las reacciones deben prepararse a temperatura ambiente (normalmente entre 22 y 25 °C) antes de la incubación isotérmica para permitir la degradación de los amplicones que contienen dU o, si se desea, una incubación de 10 minutos a 25 °C antes de añadir LAMP al flujo de trabajo. Dado que LAMP puede generar grandes cantidades de ADN en muy poco tiempo, las mejores prácticas para reducir la contaminación consisten en no abrir las reacciones LAMP después de la amplificación. P: Se produjo una amplificación en mis muestras de NTC tras la incubación isotérmica. ¿Qué ocurrió? R: La amplificación en el control sin molde dentro de los 30 minutos puede indicar contaminación cruzada durante la configuración de la reacción o un problema sistémico. Algunos conjuntos de cebadores son más susceptibles a la amplificación inespecífica que otros. Recomendamos evaluar al menos dos conjuntos de cebadores LAMP para cualquier diana. Además, algunos formatos de reacción o flujos de trabajo pueden ser más propensos a la amplificación inespecífica con conjuntos de cebadores particulares, como: Grandes volúmenes de reacción en recipientes pequeños (p. ej., 20 µL en placas de 384 pocillos) Bajas temperaturas de reacción (p. ej., 60 °C en lugar de 65 °C) Si se utiliza un termociclador en tiempo real, se puede incluir una curva de fusión o desnaturalización después de la incubación LAMP para distinguir entre la amplificación espuria y la contaminación cruzada, ya que cada amplicón LAMP producirá un perfil de fusión único. Si la reacción NTC es positiva tras repetir la prueba o modificar el flujo de trabajo, reemplace todas las existencias de reactivos y limpie el espacio de trabajo con un descontaminante de superficies aceptable, como lejía al 10 % (dilución 1:10 de hipoclorito de sodio comercial al 5,25-6,0 %). P: ¿Cuáles son las ventajas de usar LAMP estándar (NEB n.° M1712, E1700, M1708, E1708) en lugar de LAMP colorimétrica basada en pH (NEB n.° M1800, M1804)? R: Nuestras mezclas maestras LAMP colorimétricas basadas en pH (NEB n.° M1800, NEB n.° M1804) utilizan una solución débilmente tamponada para permitir la detección visual con un colorante sensible al pH. Esta sencilla lectura visual puede ser especialmente útil para las pruebas en el punto de necesidad. Sin embargo, la baja capacidad de tamponamiento necesaria para provocar el cambio de color de rosa a amarillo limita la compatibilidad de las muestras, ya que las muestras con un alto contenido de tampón o las muestras ácidas pueden afectar el cambio de color. Las mezclas maestras de nuestros productos LAMP estándar (NEB #M1712, NEB #E1700, NEB #M1708, NEB #E1708) toleran mejor este tipo de muestras. Estos productos también son compatibles con la detección colorimétrica sin pH. Las mezclas maestras LAMP/RT-LAMP de NEB permiten elegir el tipo de muestra y el cambio de color visual. Las mezclas maestras LAMP colorimétricas basadas en pH de NEB con UDG (NEB #M1804) o sin UDG (NEB #M1800) están tamponadas débilmente para permitir la detección visual de la amplificación con rojo de fenol, un colorante sensible al pH. La baja capacidad tampón permite que el pH de la reacción disminuya a medida que se producen protones en la amplificación del ácido nucleico diana, generando un cambio de color de rosa a amarillo. Esta sencilla lectura visual puede ser especialmente útil para las pruebas en el punto de necesidad. Sin embargo, la baja capacidad tampón requerida para la detección basada en pH limita la compatibilidad de las muestras con las mezclas LAMP colorimétricas basadas en pH. Las muestras altamente tamponadas pueden inhibir el cambio de color, mientras que las muestras ácidas pueden disminuir el pH de la reacción lo suficiente como para afectar el color inicial. La mezcla maestra multipropósito LAMP/RT-LAMP 2X con UDG (NEB #M1708, NEB #E1708) o sin UDG (NEB #E1700) está completamente tamponada y tolera mejor este tipo de muestras, lo que la hace compatible con otros colorantes colorimétricos (p. ej., azul de hidroxinaftol, un indicador metálico). P: ¿Se requiere un paso de incubación independiente para RT-LAMP? R: No se requiere un paso de transcripción inversa independiente para realizar RT-LAMP, ya que WarmStart RTx Reverse Transcriptase produce ADNc durante la incubación isotérmica a 65 °C. P: ¿NEB tiene una mezcla maestra para reacciones LAMP o RT-LAMP? R: Sí. Ofrecemos varias opciones compatibles con los protocolos LAMP/RT-LAMP. El kit WarmStart® LAMP (ADN y ARN) (NEB n.° E1700) incluye un colorante fluorescente LAMP 50X para la detección fluorescente de reacciones LAMP/RT-LAMP. La mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X (ADN y ARN) (NEB n.° M1800) incluye un indicador colorimétrico basado en pH para la detección visual de reacciones LAMP/RT-LAMP (un cambio de color de rosa a amarillo indica amplificación). Las versiones actualizadas de ambos productos incluyen UDG termolábil y dUTP para reducir el riesgo de contaminación por arrastre (NEB n.° E1708 y NEB n.° M1804, respectivamente). Además, la mezcla maestra multiusos WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) (NEB n.° M1708) es compatible con diferentes tipos de entrada de muestra y admite múltiples métodos de detección, incluido el azul de hidroxinaftol. Todas las mezclas maestras LAMP incluyen una combinación de transcriptasa inversa WarmStart RTx y ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart para una amplificación rápida y robusta de dianas de ADN y ARN. Cada mezcla requiere únicamente cebadores LAMP suministrados por el usuario y muestras de ADN o ARN diana. P: ¿Qué son LAMP y RT-LAMP? R: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin necesidad de equipos sofisticados. Utiliza una ADN polimerasa con desplazamiento de soporte, como la ADN polimerasa Bst, y de 4 a 6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas del ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP ofrece alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) con resultados rápidos: las reacciones se pueden realizar en tan solo 5 a 10 minutos. Las reacciones se pueden realizar con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con instrumentos de medición en tiempo real y de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, con RT-LAMP funcionando como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB #M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN, acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad de RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de aplicaciones LAMP. P: ¿Qué tipo de purificación se recomienda para los cebadores LAMP? R: Al cribar varios conjuntos de cebadores LAMP para identificar aquellos con un rendimiento óptimo para una diana determinada, la desalinización estándar suele ser suficiente. Sin embargo, recomendamos la purificación por PAGE o HPLC de los cebadores FIP y BIP como mínimo para el ensayo final para garantizar la robustez en cuanto al tiempo de detección y la sensibilidad.