New England Biolabs, E2065S, Kit de ARNm HiScribe® T7 ARCA

Ahora incluye un tubo separado de DTT Categorías relacionadas Capping de ARN,, Síntesis de ARN Transcripción in vitro (IVT),, Soluciones de nucleótidos para ARN Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Preguntas frecuentes P: Kit de ARNm HiScribe® T7 ARCA (con cola) ¿Cuál es la diferencia entre el kit de ARNm HiScribe T7 ARCA (NEB #E2065) y el kit de ARNm HiScribe T7 ARCA (con cola) (NEB #E2060)? R: Ambos kits de ARNm HiScribe T7 ARCA se pueden usar para sintetizar ARN mediante capping cotranscripcional con ARCA. Los kits de ARNm HiScribe T7 ARCA proporcionan una solución fácil para producir ARNm con capuchón ARCA. E2065 está destinado a plantillas que tienen una cola de poli(A) codificada. Para plantillas sin colas de poli(A) codificadas, el kit #E2060 contiene poli(A) polimerasa de E. coli para añadir colas de poli(A) tras la transcripción y la caperuza. P: Actualmente utilizo el kit de transcripción MessageMAX™ T7 ARCA-capped Message, ¿qué kit de síntesis de ARNm de NEB debería utilizar? R: Recomendamos el kit de ARNm HiScribe T7 ARCA (E2065), que cotranscribe ARCA, pero no incluye poli(A) polimerasa. Para su uso cuando no se necesita la cola enzimática de poli(A) o la cola de poli(A) está codificada en la plantilla. El kit HiScribe contiene reactivos y protocolos para la síntesis cotranscripcional de ARCA y la caperuza de 20 reacciones de síntesis. P: Actualmente utilizo el kit de transcripción mMessage mMachine® T7 Ultra, ¿qué kit de síntesis de ARNm de NEB debería utilizar? R: Recomendamos el kit de ARNm HiScribe T7 ARCA (con cola) (E2060), que permite la cotranscripcionalización con ARCA y la posterior adición de una cola de poli(A) mediante la polimerasa de E. coli. El kit HiScribe contiene reactivos y protocolos para la cotranscripcionalización completa de ARCA y la adición de cola en las reacciones de síntesis. P: ¿Se pueden utilizar nucleótidos modificados con los kits de ARNm HiScribe T7 ARCA? R: Los kits de ARNm HiScribe T7 ARCA permiten la incorporación de 5mCTP y pseudo-UTP al ARNm. Se pueden añadir hasta 2,5 mM de nucleótidos modificados en total a la reacción sin afectar significativamente el rendimiento del ARNm. Se pueden utilizar otros UTP y CTP modificados, pero el rendimiento variará según las propiedades de los nucleótidos. No se deben utilizar GTP ni ATP modificados, ya que interfieren con la eficiencia de la cotranscripción y la adición de cola. P: ¿Cuál es la diferencia entre los kits de ARNm HiScribe T7 ARCA y los kits de síntesis de ARN de alto rendimiento HiScribe T7 (E2040) y HiScribe T7 Quick RNA Synthesis Kit (E2050)? R: Consulte la tabla de selección para elegir el kit HiScribe adecuado para su aplicación. P: ¿Puedo usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para limpiar mi reacción de transcripción in vitro (IVT)? R: Sí, el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg) (NEB n.° T2040) es adecuado para limpiar reacciones de transcripción in vitro donde no se espera que el rendimiento supere los 50 µg. Si se espera que el rendimiento de ARN de una transcripción in vitro supere los 50 µg, recomendamos dividir la reacción entre varias columnas Monarch Spin RNA Cleanup (50 µg) o limpiarla con el kit Monarch Spin RNA Cleanup (500 µg) (NEB n.º T2050), debido a la mayor capacidad de unión del ARN. P: ¿Cómo puedo mejorar un bajo rendimiento de ARN de la reacción de transcripción? R: Si la reacción de transcripción con su plantilla genera ARN de longitud completa, pero el rendimiento es significativamente menor de lo esperado, es posible que los contaminantes en la plantilla de ADN estén inhibiendo la ARN polimerasa o que la concentración de ADN sea incorrecta. Alternativamente, puede que se requiera una purificación adicional de la plantilla de ADN. Añadir 5 mM de DTT (final) a la reacción de transcripción también puede ayudar a mejorar el rendimiento de ARN. P: ¿Se incluyen nucleótidos modificados en el kit? R: Los nucleótidos modificados no están incluidos en el kit, pero se pueden comprar por separado. NEB puede proporcionar N1-Metil-Pseudouridina-5'-Trifosfato (NEB #N0431), 5-Metil-Citidina-5'-Trifosfato (NEB #N0432), Pseudouridina-5'-Trifosfato (NEB #N0433) y 5-Metoxi-Uridina-5'-Trifosfato (NEB #N0434). El manual del kit incluye un protocolo detallado para el uso de nucleótidos modificados en la reacción de transcripción. P: ¿Es necesario añadir DTT a la reacción? R: Añadir DTT (5 mM final) a la reacción es opcional, pero se recomienda. La ARN polimerasa del kit es sensible a la oxidación y podría reducir la producción de ARN con el tiempo debido a la manipulación repetida, etc. Añadir DTT a la reacción puede ayudar a restaurar el rendimiento del kit en estos casos. Añadir DTT no afectará la reacción en ningún caso.