Product Description
Categorías relacionadas Capping de ARN,, Síntesis de ARN Transcripción in vitro (IVT),, Soluciones de nucleótidos para ARN Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la secuencia promotora de la ARN polimerasa SP6? R: La secuencia promotora de SP6 es 5' ATTTAGGTGACACTATAG 3'. La ARN polimerasa SP6 comienza la transcripción en la G subrayada en la secuencia promotora de doble cadena. Luego, la polimerasa transcribe usando la cadena opuesta como plantilla en la dirección 5' a 3'. La primera base en la transcripción será una G. P: ¿La transcripción con la ARN polimerasa SP6 requiere un cebador? R: No. A diferencia de las ADN polimerasas, no se necesitan cebadores para la actividad de la ARN polimerasa SP6. La región promotora SP6 debe ser bicatenaria para que la polimerasa reconozca la secuencia promotora, comenzando la transcripción en la G final. La polimerasa luego transcribe usando la cadena opuesta como molde de 5' a 3'. Los plásmidos linealizados, los productos de PCR o los oligonucleótidos de ADN sintéticos annealed a un oligonucleótido corto que contiene el promotor SP6 pueden servir como moldes para la transcripción in vitro con la ARN polimerasa SP6. P: ¿La ARN polimerasa SP6 deja una base extra al final del transcrito? R: Sí, la ARN polimerasa SP6 puede dejar una o algunas bases extra en el extremo 3' del transcrito, lo que resulta en un grupo de transcripciones con extremos 3' heterogéneos. P: ¿La ARN polimerasa SP6 iniciará la transcripción a partir de un molde de ADN monocatenario? R: No. La región promotora debe ser bicatenaria para que la polimerasa la reconozca e inicie la transcripción. La polimerasa luego transcribe usando la cadena opuesta como plantilla en la dirección 5' a 3'. P: ¿Funcionará la ARN polimerasa SP6 en un plásmido sin cortar? R: Sí, aunque la SP6 es una enzima extremadamente procesiva y continuará transcribiendo alrededor de una plantilla circular varias veces sin disociarse. El plásmido se puede linealizar con enzimas de restricción que dejan un saliente romo o 5' aguas abajo del ADN de interés, lo que resulta en una transcripción de run-off. P: ¿Se puede producir ARN aberrante usando la ARN polimerasa SP6? R: Sí. Ha habido informes de que se produce ARN aberrante al linealizar un plásmido usando enzimas de restricción que dejan salientes 3'. Para evitar esto, el plásmido debe linealizarse usando enzimas de restricción que dejen un saliente romo o 5' justo aguas abajo del ADN de interés. P: ¿Se pueden sustituir los componentes del kit de síntesis de ARN HiScribe SP6 por la ARN polimerasa SP6 y el tampón de reacción (NEB n.° M0207)? R: No. Los componentes del kit han sido especialmente formulados y deben utilizarse con los protocolos proporcionados para obtener resultados óptimos. Las formulaciones son diferentes de la enzima y el tampón incluidos en NEB n.° M0207 y no se pueden sustituir. P: ¿Cuál es la secuencia de la plantilla de control SP6? R: La secuencia de la plantilla de control SP6 (pCLuc-SP6), que contiene el gen de la luciferasa de Cypridina bajo el control del promotor SP6, se puede encontrar en la herramienta de secuencias y mapas de ADN en neb.com. P: ¿Puedo usar los kits de limpieza de ARN Monarch Spin para limpiar mi reacción de transcripción in vitro (IVT)? R: Sí, el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg) (NEB n.° T2040) es adecuado para la limpieza de reacciones de transcripción in vitro donde no se espera que el rendimiento de ARN supere los 50 µg. Si se espera que el rendimiento de ARN de una transcripción in vitro supere los 50 µg, recomendamos dividir la reacción entre varias columnas de limpieza de ARN Monarch Spin (50 µg) o limpiarla con el kit de limpieza de ARN Monarch Spin (500 µg) (NEB n.° T2050), debido a su mayor capacidad de unión al ARN. P: ¿El kit incluye nucleótidos modificados? R: Los nucleótidos modificados no están incluidos en el kit, pero pueden adquirirse por separado. NEB puede proporcionar N1-Metil-Pseudouridina-5'-Trifosfato (NEB #N0431), 5-Metil-Citidina-5'-Trifosfato (NEB #N0432), Pseudouridina-5'-Trifosfato (NEB #N0433) y 5-Metoxi-Uridina-5'-Trifosfato (NEB #N0434). El manual del kit incluye un protocolo detallado para el uso de nucleótidos modificados en la reacción de transcripción. P: ¿Es necesario añadir DTT a la reacción? R: Añadir DTT (5 mM final) a la reacción es opcional, pero se recomienda. La ARN polimerasa del kit es sensible a la oxidación y podría reducir la producción de ARN con el tiempo debido a la manipulación repetida, etc. Añadir DTT a la reacción puede ayudar a restaurar el rendimiento del kit en estos casos. Añadir DTT no afectará la reacción en ningún caso.
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