New England Biolabs, E2080S, Kit de ARNm HiScribe® T7 con reactivo CleanCap® AG...

Ahora incluye un tubo separado de DTT Categorías relacionadas Capping de ARN,, Síntesis de ARN Transcripción in vitro (IVT),, Soluciones de nucleótidos para ARN Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Preguntas frecuentes P: ¿Necesito cambiar mi secuencia promotora para usar CleanCap® Reagent AG? R: La secuencia del promotor de ARN T7 en sí (5′ TAATACGACTCACTATA 3′) no necesita ser cambiada ya que el kit todavía utiliza ARN polimerasa T7. Sin embargo, las dos bases iniciadoras (+1 y +2) que están justo aguas abajo del promotor T7 necesitan ser “AG”. (La base +1 después del promotor de ARN polimerasa T7 estándar siempre es una “G”. Sin embargo, la base +2 puede ser cualquier base (N)). Promotor original con base iniciadora +1 (G) y +2 (N) 5′ TAATACGACTCACTATAGN 3′ Se requiere una nueva secuencia para usar con el reactivo CleanCap® AG (con bases iniciadoras AG) 5′ TAATACGACTCACTATAAG 3′ P: ¿Cómo puedo cambiar la secuencia iniciadora de mi plantilla de dsADN? R: Si su secuencia de interés se clona en un plásmido, recomendamos usar el kit de mutagénesis dirigida Q5® (NEB n.° E0554S) para cambiar las bases iniciadoras +1 y +2 a AG. Antes de la transcripción, el plásmido deberá linealizarse (usando una enzima de restricción que deja un extremo romo o saliente en el extremo 5′) para crear una plantilla de transcripción in vitro de doble cadena. Consulte el manual del producto para la preparación de la plantilla de ADN. Como alternativa, se puede realizar la PCR utilizando un cebador directo diseñado para incluir el promotor T7 (con unas pocas bases aguas arriba) y el cambio de G a A en el nucleótido iniciador, así como alguna secuencia aguas abajo. Diseñe el cebador inverso para que se annealice a la región donde terminará su secuencia. P: ¿Será la base 5' de mi ARN una "A"? R: Sí. La A +1 será la primera base incorporada al ARN transcrito utilizando el kit de ARNm HiScribe® T7 con CleanCap® Reagent AG. El ARN tendrá una estructura Cap1 natural. P: ¿Se puede utilizar un plásmido sin cortar como plantilla para el kit de ARNm HiScribe® T7 con CleanCap® Reagent AG? R: No. La ARN polimerasa T7 es una enzima extremadamente procesiva y continuará transcribiendo alrededor de una plantilla circular varias veces sin disociarse. El plásmido se puede linealizar con enzimas de restricción que dejan un saliente romo o 5′ aguas abajo del ADN de interés, lo que resulta en una transcripción de run-off. Consulte el manual del producto para la generación de plantillas de ADN. P: ¿Se pueden usar nucleótidos modificados con el kit de ARNm HiScribe® T7 con CleanCap® Reagent AG? R: Sí. Para una sustitución completa, omita el NTP sin marcar que viene con el kit y complemente con la misma concentración final de un NTP modificado (CTP o UTP) de su elección. Debe evitarse el ATP modificado, ya que interferirá con la incorporación del CleanCap® Reagent AG. Cabe destacar que algunos NTP modificados pueden afectar el rendimiento final de la reacción de síntesis y es posible que sea necesario optimizar las proporciones de NTP modificados:no modificados para sustituciones parciales. Consulte el protocolo en el manual del producto para su uso con NTP modificados. P: ¿Cómo puedo mejorar el rendimiento del ARN al usar el kit de ARNm HiScribe® T7 con CleanCap® Reagent AG? R: Asegúrese de que los NTP, el reactivo AG CleanCap®, el tampón 10X y la plantilla de ADN bicatenario estén descongelados y mantenidos a temperatura ambiente durante la preparación de la reacción (mantenga la mezcla de ARN polimerasa T7 en hielo). Asegúrese de que estos componentes (NTP, reactivo AG CleanCap®, tampón 10X y plantilla de ADN bicatenario) estén bien mezclados antes de su uso, agitando suavemente en vórtex durante 2-3 segundos y centrifugando en una microcentrífuga para recoger el líquido del fondo del tubo. Prepare la reacción a temperatura ambiente en el orden indicado en el manual. Mezcle suavemente la reacción pipeteando y centrifugando brevemente en una microcentrífuga antes de mover la reacción a 37 °C. Además, asegúrese de utilizar tubos y puntas con filtro libres de ARNasa, y use siempre guantes al manipular los reactivos y las reacciones. Asegúrese de que la plantilla de ADN esté muy limpia y verifique que la concentración sea correcta. P: ¿Cómo puedo purificar el ARN sintetizado con este kit? R: El ARN de más de 300 nucleótidos se puede purificar utilizando la solución de cloruro de litio (LiCl) incluida en el kit, siguiendo las instrucciones del manual. Como alternativa, recomendamos el kit de limpieza de ARN Monarch® de 500 µg (NEB n.° T2050) para la purificación de ARN. El rendimiento esperado de una sola reacción de ARN sin modificar con este kit es de más de 90 µg. P: ¿Se pueden sustituir en este kit los componentes de otros kits HiScribe®, la ARN polimerasa T7 (NEB n.° M0251) o el tampón de reacción RNAPol (NEB n.° B9012)? R: No. La formulación de los componentes de este kit se ha optimizado para la transcripción in vitro utilizando 5 mM de CTP, 5 mM de GTP, 5 mM de UTP, 6 mM de ATP y 4 mM de reactivo CleanCap® AG en una reacción de 20 µl. P: ¿Recomiendan codificar la cola de poli(A) con una plantilla o usar la poli(A) polimerasa de E. coli? R: Ambos métodos darán como resultado un ARNm con una cola de poli(A). Sin embargo, usar una cola de poli(A) codificada con una plantilla reducirá el tiempo total del proceso de trabajo y dará como resultado una longitud de cola de poli(A definida. Si se usa la poli(A) polimerasa (NEB n.° M0276), recomendamos purificar la reacción de IVT antes de añadir la cola de poli(A). Usar la poli(A) polimerasa resultará en una variedad de longitudes de cola y un mayor tiempo de trabajo. P: ¿Puedo usar un análogo de reactivo CleanCap® diferente con este kit? R: Recomendamos usar el reactivo CleanCap® AG incluido en este kit, ya que las formulaciones se han optimizado para su uso con este análogo de capuchón de trinucleótido específico. Los reactivos CleanCap GG y Cleancap GG (3′ OMe) no son compatibles con las formulaciones ni las proporciones de NTP incluidas en este kit. TriLink ofrece el reactivo CleanCap AG (3′ OMe), pero no se ha probado específicamente con las formulaciones proporcionadas en este kit. P: ¿El kit incluye nucleótidos modificados? R: Los nucleótidos modificados no están incluidos en el kit, pero pueden adquirirse por separado. NEB puede proporcionar N1-metil-pseudouridina-5'-trifosfato (NEB n.° N0431), 5-metil-citidina-5'-trifosfato (NEB n.° N0432), pseudouridina-5'-trifosfato (NEB n.° N0433) y 5-metoxi-uridina-5'-trifosfato (NEB n.° N0434). El manual del kit incluye un protocolo detallado para el uso de nucleótidos modificados en la reacción de transcripción. P: ¿Es necesario añadir DTT a la reacción? R: La adición de DTT (5 mM final) a la reacción es opcional, pero se recomienda. La ARN polimerasa del kit es sensible a la oxidación y podría resultar en una menor producción de ARN con el tiempo debido a la manipulación repetida, etc. Añadir DTT a la reacción puede ayudar a restablecer el rendimiento del kit en estos casos. Añadir DTT no afectará la reacción en ningún caso.