New England Biolabs, E2610L, kit de adenilación de ADN 5'

Categorías relacionadas Preguntas frecuentes sobre ligadura de ARN P: ¿Se puede usar este kit de adenilación de ADN 5' para adenilar oligos de ARN monocatenario? R: Sí, este kit puede adenilar el extremo 5' de oligos de ARN monocatenario. P: ¿Cuál es el peso molecular de la ARN ligasa Mth? ¿Es una proteína de fusión? R: La ARN ligasa Mth es una proteína de fusión His10 con un peso molecular de 46 kDa. P: ¿Qué proporción molar de enzima a oligonucleótido recomiendan? R: Recomendamos una proporción molar de uno a uno de enzima a oligonucleótido para la adenilación de los sustratos más difíciles. Para algunos oligonucleótidos, es suficiente de 2 a 4 veces menos enzima. P: ¿Se puede usar la ARN ligasa Mth en otros NEBuffers? R: No. La eficiencia de marcaje óptima para esta enzima se logra solo en el tampón de reacción de adenilación de ADN 5' independiente de la temperatura que se suministra con el producto. El pH 6,0 es crítico. P: ¿Se puede usar la ARN ligasa Mth para la ligadura? R: No. Las condiciones de reacción están optimizadas para la adenilación del 5'-ADN. P: ¿El PEG estimula la adenilación? R: No. El PEG no estimula la adenilación. P: ¿Qué concentración de ATP se debe utilizar en la reacción de adenilación? R: Se puede utilizar un rango de 0,05 a 0,5 mM de ATP. 0,1 mM de ATP es óptimo para la condición de reacción recomendada. P: ¿Funcionará la enzima a baja temperatura (p. ej., 37 °C)? R: La ARN ligasa Mth requiere una temperatura elevada para su activación, con una actividad óptima a 65 °C. Bajar la temperatura requerirá una extensión del tiempo de reacción, que se debe determinar empíricamente. Para la purificación de ssADN, asegúrese de seguir las recomendaciones detalladas en la pregunta frecuente n.º 8 de T1030. P: ¿Cómo determino el grado de adenilación? R: Un oligonucleótido adenilado se mueve aproximadamente 1 base más lento en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15 o 20 %. Si el 5'-fosfato está marcado, también se vuelve resistente a la fosfatasa. Para oligonucleótidos >18 bases, el Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (T1030) es el producto recomendado para purificar oligos adenilados después de la reacción. El protocolo está disponible a través del siguiente enlace: Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) P: ¿Necesito limpiar la reacción de adenilación antes de usar el oligo para la ligadura? R: Recomendamos calor o tratamiento con proteinasa K para inactivar la enzima. El exceso de ATP debe eliminarse de la reacción, ya sea por precipitación o cromatografía en columna, para evitar interferencias con el paso de ligadura posterior. P: ¿Cuál es la composición del tampón de reacción de adenilación de ADN 5' a una concentración 1X? A: El tampón de reacción de adenilación de ADN 5' a una concentración 1X es: 50 mM de acetato de sodio (pH 6,0 a 25 °C) 10 mM de MgCl2 5 mM de DTT 0,1 mM de EDTA P: ¿Cuál es la tolerancia a la sal de esta ARN ligasa? A: NEB n.º ARN ligasa Tolerancia a la sal M0204 T4 ARN ligasa 1 (ssRNA ligasa) ≤ 50 mM M0239 T4 ARN ligasa 2 (dsRNA ligasa) ≤ 50 mM M0242 T4 ARN ligasa 2, truncada ≤ 100 mM M0351 T4 ARN ligasa 2, truncada K277Q ≤ 100 mM M0373 T4 ARN ligasa 2, truncada KQ ≤ 100 mM M0375 SplintR Ligasa ≤ 50 mM E2610 Kit de Adenilación 5' (Ligasa Mth) ≤ 300 mM M0319 Ligasa de ADN/ARN termoestable 5' App ≤ 50 mM P: ¿Cómo puedo ampliar mi reacción de adenilación? R: Para aplicaciones a mayor escala, puede aumentar el volumen de reacción y utilizar nuestra Ligasa de ARN Mth de Alta Concentración, disponible exclusivamente a través del canal de Soluciones Personalizadas. Esto permite ampliar la reacción de adenilación hasta 30 pmol de oligonucleótido y 30 pmol de enzima por µl sin pérdida de eficiencia. Después de la reacción, el oligonucleótido se puede purificar mediante extracción con fenol y precipitación con alcohol o cromatografía en columna para eliminar eficazmente la proteína y el ATP.