New England Biolabs, E2611L, mezcla maestra Gibson Assembly®

Gibson Assembly Master Mix ha sido reformulado con componentes que contienen albúmina recombinante (rAlbúmina) a partir del lote n.° 10229799. Categorías relacionadas Kits de ensamblaje, clonación y mutagénesis de ADN Aplicaciones Especificación de ensamblaje de Gibson Materiales necesarios pero no suministrados Opciones de ADN polimerasa recomendadas para PCR ADN polimerasa de alta fidelidad Q5® (NEB n.º M0491) ADN polimerasa Q5 Hot Start Flex (NEB n.º M0493) Mezcla maestra Q5 Hot Start Flex 2X (NEB n.º M0494) Placas LB (Luria-Bertani) con antibiótico apropiado Medio de crecimiento SOC (NEB n.º B9020) Opciones de células competentes para transformación E. coli competente NEB 5-alfa (alta eficiencia, NEB n.º C2987) E. coli competente NEB 10-beta (alta eficiencia, NEB n.º C3019) (recomendado para productos ensamblados mayores de 10 kb) E. coli electrocompetente NEB 10-beta (NEB n.º C3020) E. coli competente estable NEB® (Alta eficiencia) (NEB n.º C3040) Notas de almacenamiento Almacenar a -20 °C. Descongelar, agitar bien en vórtex antes de usar y mantener en hielo. Preguntas frecuentes P: ¿No estoy seguro de si elegir NEBuilder HiFi DNA Assembly o NEB Gibson Assembly? ¿En qué se diferencian los productos? R: NEBuilder HiFi DNA Assembly ofrece varias ventajas sobre NEB Gibson Assembly. NEBuilder HiFi utiliza una polimerasa patentada de mayor fidelidad, lo que resulta en menos cribado/resecuenciación de constructos y un ensamblaje de alta fidelidad prácticamente sin errores. Esta característica también permite que NEBuilder se use en ciertas aplicaciones para las que NEB Gibson Assembly no se puede usar: NEBuilder HiFi elimina los desajustes de los extremos 5' y 3', y se puede usar en rondas sucesivas de ensamblaje. Esto ahorra tiempo al evitar los largos pasos de amplificación por PCR. NEBuilder HiFi puede unir dos fragmentos ds con un oligonucleótido de ssDNA sintético para una construcción simple y rápida (p. ej., inserción de enlazador o biblioteca de gRNA). Para obtener información y datos más detallados, visite NEBuilderHifi.com. P: ¿Cuáles son las ventajas de este método en comparación con los métodos de clonación tradicionales? R: El método Gibson Assembly permite la inserción de uno o más fragmentos de ADN en prácticamente cualquier posición del vector linealizado y no depende de la presencia de sitios de restricción dentro de una secuencia particular que se vaya a sintetizar o clonar. Por lo tanto, el usuario tiene control total sobre lo que se ensambla y se puede evitar la inserción de secuencias adicionales no deseadas, a menudo utilizadas para facilitar la manipulación de múltiples secuencias de ADN. Además, el método Gibson Assembly es rápido en comparación con la clonación estándar basada en enzimas de restricción. Por último, se puede unir un mayor número de fragmentos de ADN en una sola reacción con mayor eficiencia que los métodos convencionales. P: ¿Qué tamaño de fragmento de ADN puedo ensamblar? R: El kit de clonación Gibson Assembly (que contiene E. coli competente con NEB 5-alfa) se ha utilizado para clonar con éxito un fragmento de ADN de 15 kb en un plásmido de 5,4 kb en E. coli, con una longitud total de hasta 20,4 kb. Sin embargo, como regla general para productos ensamblados mayores de 10 kb, NEB recomienda NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C3019) o NEB 10-beta Electrocompetent E. coli (NEB #C3020). P: ¿Cuántos fragmentos de ADN se pueden ensamblar en una reacción? R: El número de segmentos de ADN que se pueden ensamblar en una reacción depende de la longitud y secuencia de los fragmentos. El ensamblaje Gibson se ha utilizado para ensamblar eficientemente hasta doce insertos de 0,4 kb en un vector a la vez. Sin embargo, recomendamos el ensamblaje de cinco insertos o menos en un vector en una reacción para producir un clon con el inserto correcto. Se puede utilizar una estrategia que involucra ensamblaje secuencial si no se pueden ensamblar todos los fragmentos en una sola reacción. Alternativamente, considere el ensamblaje Golden Gate para ensamblajes de >6 fragmentos. P: ¿Cuáles son los solapamientos más cortos que se pueden utilizar con este método de ensamblaje? R: Se ha logrado un ensamblaje productivo de fragmentos de ADN con una superposición de tan solo 12 pb; sin embargo, esto depende del contenido de GC en la superposición. Recomendamos usar superposiciones de al menos 15 pb, o más, para el ensamblaje de dsADN con una Tm ≥ 48 °C (par AT = 2 °C y par GC = 4 °C). Aumentar la longitud de la superposición entre fragmentos también reduce la cantidad de ADN necesaria para el ensamblaje. P: ¿Cuáles son las superposiciones más largas que se pueden usar con este método? R: La cantidad de exonucleasa en la mezcla maestra de ensamblaje Gibson se ha optimizado para el ensamblaje de moléculas de ADN con superposiciones ≤ 100 pb. P: ¿Se pueden ensamblar fragmentos de dsADN ≤ 200 pb con este método? R: Sí. Para obtener resultados óptimos, utilice cada fragmento más pequeño en un exceso molar ≥ 5 veces mayor que el vector (inserto: vector 5:1) y mantenga la cantidad total de ADN en la reacción de Gibson a 0,02-0,5 pmoles. P: ¿Se pueden combinar y ensamblar oligonucleótidos de ssDNA con fragmentos de dsDNA? R: Sí. Sin embargo, se debe determinar la concentración óptima de cada oligonucleótido. Como punto de partida, recomendamos utilizar 45 nM de cada oligonucleótido que sea menor o igual a doce oligonucleótidos de 60 bases que contengan superposiciones de 30 bases. P: ¿Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos o más cortos? R: Sí. Para ensamblar 2-3 fragmentos, son suficientes tiempos de incubación de 15 minutos. Para ensamblar 4-6 fragmentos, se recomiendan tiempos de incubación de 60 minutos. Por lo general, no se recomiendan tiempos de reacción inferiores a 15 minutos. Se ha demostrado que los tiempos de incubación prolongados (hasta 4 horas) mejoran la eficiencia del ensamblaje en algunos casos. No incubar la reacción durante la noche. P: ¿Funcionará la reacción a otras temperaturas? R: La reacción se ha optimizado a 50 °C, pero se ha demostrado que funciona entre 40 °C y 50 °C. P: ¿Es necesario inactivar las enzimas de restricción después de la digestión del vector? R: La inactivación de las endonucleasas de restricción generalmente no es necesaria, pero en algunos casos puede aumentar la eficiencia de la transformación. Si el inserto también contiene el sitio de restricción utilizado para linealizar el vector, es necesario inactivar la enzima de restricción por calor antes de mezclar el vector linealizado con el inserto en el ensamblaje Gibson. Si se utilizó una enzima de restricción resistente al calor para linealizar el vector, este debe purificarse mediante columnas de ADN, extracción con fenol-cloroformo o extracción en gel de agarosa después de la electroforesis, antes de entrar en contacto con el inserto. P: Me gustaría producir fragmentos de dsADN superpuestos mediante PCR. ¿Necesito utilizar cebadores de PCR purificados por PAGE o HPLC? R: No. Se pueden utilizar cebadores estándar desalinizados. P: Me gustaría ensamblar oligonucleótidos de ssADN en fragmentos de dsADN. ¿Necesito usar oligonucleótidos purificados por PAGE o HPLC? R: No. Se pueden usar cebadores estándar desalinizados. Para obtener más información, descargue la nota de aplicación "Construcción de un vector de expresión sgRNA-Cas9 mediante puentes de oligonucleótidos de ADN monocatenario de fragmentos de ADN bicatenario". P: ¿Puedo usar una superposición de 15 nucleótidos compuesta íntegramente por repeticiones de la etiqueta His (es decir, CACCACCACCACCAC)? R: No, después de la etiqueta His, debe incluir al menos 3 nucleótidos que no formen parte de la secuencia repetitiva de la etiqueta His. Evite las secuencias repetidas al final de una superposición. P: ¿Se puede amplificar por PCR el producto ensamblado? R: Sí. La molécula de ADN ensamblada está unida covalentemente y puede amplificarse por PCR. Además, si el producto final es una molécula de ADN circular cerrada, puede usarse como plantilla en la amplificación por círculo rodante (RCA). P: ¿Qué debo hacer si mi reacción de ensamblaje no produce colonias, solo unas pocas colonias o clones con un tamaño de inserto incorrecto tras la transformación en E. coli? R: Ensamble y transforme el control positivo proporcionado con la mezcla maestra de ensamblaje Gibson. El ensamblaje exitoso de un control positivo demostrará que la mezcla de ensamblaje es funcional y que las condiciones de transformación son adecuadas. Analice la reacción en un gel de agarosa. Una reacción de ensamblaje eficiente mostrará productos ensamblados del tamaño correcto y la desaparición de fragmentos. Revise el diseño del cebador de los fragmentos de ADN superpuestos para asegurar que haya suficiente superposición para facilitar el ensamblaje. Considere si el inserto clonado puede ser tóxico para E. coli y se debe utilizar un vector de bajo número de copias, como un BAC. Dado que el producto ensamblado es una molécula cerrada covalentemente, puede amplificarse alternativamente mediante PCR o RCA. Nuestras pruebas indican que la elección de células competentes es crucial. Recomendamos el uso de células químicamente competentes de alta eficiencia, como NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) (NEB n.° C2987). La reacción se puede añadir directamente a las células sin diluir, aunque una mayor dilución de la mezcla de reacción puede mejorar la eficiencia de la transformación. Sin embargo, al utilizar células químicamente competentes de alta eficiencia de otros proveedores, si no se obtienen colonias, recomendamos una dilución 1:4 de la reacción antes de la transformación. Para la transformación en todas las células electrocompetentes de alta eficiencia, incluidas las NEB, recomendamos una dilución 1:3 de la reacción. P: ¿Cómo puedo reducir el número de colonias de fondo solo de vector? R: Para reducir significativamente el fondo de colonias no deseadas solo de vector, el vector debe ser un producto de PCR en lugar de un fragmento de restricción. Si el fondo continúa siendo un problema, el vector amplificado por PCR se puede tratar con DpnI para eliminar el arrastre de plantilla, si corresponde, extraído de un gel de agarosa después de la electroforesis. P: ¿Qué tipo de células competentes son adecuadas para la transformación de construcciones de ADN creadas con Gibson Assembly? R: Las construcciones de ADN resultantes son compatibles con la mayoría de las células competentes de E. coli. NEB recomienda usar E. coli competente NEB 5-alfa (alta eficiencia, NEB n.° C2987). Si los productos ensamblados superan los 10 kb, NEB recomienda usar E. coli competente NEB 10-beta (alta eficiencia, NEB n.° C3019) o E. coli electrocompetente NEB 10-beta (NEB n.° C3020). Si los genes ensamblados contienen secuencias repetitivas, se debe usar E. coli competente estable NEB (NEB n.° C3040). P: ¿Puedo usar electroporación en lugar de transformación química? R: Sí, pero es necesario diluir el producto de la reacción de ensamblaje de Gibson al triple y usar solo 1 μl para la electroporación. Nota: Las células proporcionadas con este kit son químicamente competentes. P: ¿Existen diferencias entre la mezcla maestra de ensamblaje de Gibson (NEB n.° E2611) y la mezcla maestra de ensamblaje de Gibson incluida en el kit de clonación de ensamblaje de Gibson (NEB n.° E5510)? R: No, la mezcla maestra es la misma en ambos kits. El kit de clonación Gibson Assembly (NEB n.º E5510) incluye E. coli químicamente competente NEB 5-alfa. P: ¿Existen diferencias entre los requisitos para ensamblajes de 2-3 fragmentos frente a 4-6? R: Las principales diferencias entre ambos son la longitud de las secuencias superpuestas entre los fragmentos adyacentes y el tiempo de incubación de la reacción de ensamblaje. El protocolo de reacción de ensamblaje de 15 minutos se recomienda para el ensamblaje de 2-3 fragmentos flanqueados por superposiciones de 15-25 nt. El protocolo de ensamblaje de 1 hora se recomienda para el ensamblaje de hasta 6 fragmentos, flanqueados por superposiciones de 20-80 nt. La cantidad total de ADN en un ensamblaje de 4-6 fragmentos también es mayor que en un ensamblaje de 2-3 fragmentos. P: La reacción de control Gibson Assembly Master Mix no me está dando colonias. ¿Por qué? R: Nuestras pruebas indican que la elección de células competentes es fundamental. Recomendamos el uso de células químicamente competentes de alta eficiencia, como NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) (NEB #C2987). La reacción se puede agregar directamente a las células sin diluir, aunque una mayor dilución de la mezcla de reacción puede mejorar la eficiencia de la transformación. Sin embargo, al usar células químicamente competentes de alta eficiencia de otros proveedores, si no se obtuvieron colonias, recomendamos una dilución 1:4 de la reacción antes de la transformación. Para la transformación en todas las células electrocompetentes de alta eficiencia, incluidas las NEB, recomendamos una dilución 1:3 de la reacción. P: Al usar una polimerasa sin actividad exonucleasa 3'-5' (como la Taq ADN polimerasa) para amplificar fragmentos que se usarán en una reacción de ensamblaje de Gibson, ¿debería preocuparme por el posible desajuste 3' generado por la adición de un nucleótido sin plantilla? R: Este tipo de desajuste 3' puede afectar la eficiencia del ensamblaje, especialmente cuando se intenta ensamblar una gran cantidad de fragmentos (4-6). En esos casos, puede ser necesario examinar más colonias para obtener el clon ensamblado correctamente. Para evitar esto, recomendamos el uso de polimerasas que producen amplicones de extremos romos, como la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5. P: ¿Es perjudicial almacenar la mezcla maestra de ensamblaje de Gibson a -80 °C? R: NEB recomienda almacenar la mezcla maestra de ensamblaje de Gibson a -20 °C; sin embargo, la mezcla maestra es estable a -80 °C. Cuando use la mezcla maestra por primera vez, transfiérala a -20 °C para su almacenamiento futuro. P: Me gustaría usar NEBuilder, pero me preocupa la privacidad de los datos del usuario. ¿Cómo maneja NEB la información que ingreso en NEBuilder? R: NEBuilder es sensible a la privacidad de los datos del usuario. En este punto, las secuencias de usuario *no* salen del navegador del cliente. Todo el procesamiento se realiza dentro del navegador del cliente. Los servidores NEB son contactados para: 1. Descargar la página y el código requerido al navegador 2. Recuperar archivos de ayuda, manuales e imágenes 3. Recuperar vector de muestra y/o insertar secuencias Ningún dato de usuario es transferido desde el navegador a través de tu firewall a los servidores de NEB. Esto puede ser verificado deshabilitando tu conexión a internet al navegador después de que la página haya cargado. Mientras que no tendrás la conveniencia de obtener secuencias de vector, el resto de la aplicación debería funcionar bien y producir los primers deseados. NEBuilder no es de código abierto en este momento, ni está disponible en una versión de escritorio independiente. P: ¿Puedo usar otras herramientas de diseño de primers tales como SnapGene para Gibson Assembly, para diseñar primers para NEBuilder HiFi DNA Assembly? R: Las reglas para diseñar primers son similares tanto para Gibson Assembly como para NEBuilder HiFi DNA Assembly. Cualquier primer diseñado para Gibson Assembly funcionará con NEBuilder HiFi. Sin embargo, algunos cebadores compatibles con NEBuilder HiFi podrían no ser compatibles con Gibson, ya que, a diferencia de la mezcla maestra de ensamblaje Gibson, la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi puede eliminar los desajustes del extremo 3'. Las herramientas que diseñan cebadores "Gibson" podrían no permitir el diseño de cebadores que aprovechen esta capacidad de NEBuilder HiFi. Si bien es posible utilizar otras herramientas, NEB recomienda nuestra herramienta gratuita, NEBuilder Assembly Tool, ya que permite diseñar cebadores que consideran los extremos del vector generados por la digestión con enzimas de restricción. P: ¿Qué resistencia a los antibióticos está codificada en el control positivo de NEBuilder (control de ensamblaje)? R: El control positivo de NEBuilder es un inserto único en un plásmido pUC19 resistente a la ampicilina. Si su mezcla de ensamblaje funciona, obtendrá colonias en una placa de ampicilina utilizando el control positivo de NEBuilder.