New England Biolabs, E2612S, Kit de enriquecimiento de ADN del microbioma NEBNext®

Categorías relacionadas Enriquecimiento de ADN del microbioma, Preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación Materiales necesarios pero no suministrados λ DNA-HindIII Digest (NEB n.º N3012) Gradilla de separación magnética de 6 tubos (NEB n.º S1506) Tinte de carga de gel azul (6X) (NEB n.º B7021) Agua sin nucleasas Gel de agarosa al 0,8 % Tampón TE 1X, pH 7,5 Perlas Agencourt® AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63881) o kit de reactivos Beckman SPRIselect (Beckman Coulter, Inc. n.º B23317) Etanol al 100 % para precipitación con alcohol, etanol al 80 % para AMPure XP o SPRIselect Tubos de microcentrífuga de baja unión con ADN Mezclador rotatorio Equipo para procesar gel Bloque de calor o termomezclador Microcentrífuga Proteinasa K, grado de biología molecular (opcional; necesaria para eluyendo ADN del huésped capturado) (NEB #P8107) Preguntas frecuentes P: ¿Puedo incubar la muestra de entrada de ADN con las perlas unidas a MBD2-Fc durante un período de tiempo más largo? R: Sí, las incubaciones más largas están bien, siempre que no excedan las 4 horas. P: ¿Qué tan importante es la proporción de perlas MBD2-Fc a ADN? R: Es vital que la proporción de perlas unidas a MBD2-Fc a entrada de ADN utilizada sea de 1 μl de perlas unidas a MBD-Fc por 6,25 ng de ADN (o 160 μl de perlas unidas a MBD-Fc por 1 μg de entrada de ADN). Es permisible aumentar la cantidad de perlas en relación con la entrada de ADN, p. ej. 320 μl de perlas magnéticas unidas a MBD2-Fc para una entrada de ADN de 2 μg. P: ¿Cuál es el volumen máximo de ADN de entrada que puedo usar por reacción? R: Recomendamos un volumen de muestra de hasta 200 μl (1 μg de ADN de entrada) para 160 μl de perlas de proteína A-MBD2Fc. Se pueden usar volúmenes de muestra mayores para 160 μl de perlas de proteína A-MBD2Fc, pero no probamos la eficiencia de enriquecimiento para volúmenes de muestra superiores a 200 μl. P: ¿Funcionará el procedimiento con ADN degradado? R: Hemos observado que el tamaño y la calidad del ADN afectan la separación del ADN del microbioma, al igual que la cantidad total de dinucleótidos CpG metilados. Por ejemplo, el ADN de fibroblastos humanos normales (IMR-90) está metilado en un 4-5% del genoma y se separa eficazmente mediante esta técnica (se elimina el 90% del ADN humano). El ADN del cáncer (HeLa, Jurkat) está menos metilado globalmente al 3%, y el enriquecimiento es menos eficiente. Del mismo modo, si el tamaño del fragmento de ADN es inferior a 15 Kb, el enriquecimiento será menos eficiente. Cuanto más grande y más metilado con CpG sea el ADN del huésped, mejor será la separación. P: ¿Cuál es el mejor método para purificar el ADN después del enriquecimiento? R: Recomendamos la limpieza con microesferas Ampure o la precipitación con etanol. P: Si el ADN de mi muestra está particularmente degradado, como es el caso de las muestras de microbioma fecal, ¿hay alguna modificación del protocolo que mejore el rendimiento del kit de enriquecimiento de ADN del microbioma NEBNext con estas muestras? R: Si bien el kit de enriquecimiento de ADN del microbioma NEBNext fue diseñado para ADN intacto de alta calidad, los usuarios informan que han modificado el protocolo con éxito para reparar mejor las muestras de ADN de baja calidad. Se pueden encontrar recomendaciones sobre cómo ajustar el protocolo en Chiou y Bergey 2018, Scientific Reports (2018) 8:1975 DOI:10.1038/s41598-018-20427-9; estas incluyen: lavados adicionales. Ajuste de la proporción de microesferas/ADN del huésped según los resultados de qPCR. 2 rondas de enriquecimiento separadas por una elución de NaCl. Consulte también un protocolo aquí: https://www.protocols.io/view/microbiome-dna-enrichment-for-fecal-seq-using-the-kqdg3xn21g25/v1