New England Biolabs, E2621L, mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder® HiFi

NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix ha sido reformulado con componentes que contienen Albúmina Recombinante (rAlbúmina) comenzando con el Lote #10238675. Categorías Relacionadas Síntesis de sgRNA,, Kits de Ensamblaje, Clonación y Mutagénesis de ADN Aplicaciones NEBuilder® HiFi DNA Assembly,, Soluciones de clonación y automatización de alto rendimiento Especificación Materiales Requeridos pero no Suministrados Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Preguntas Frecuentes P: No estoy seguro si elegir NEBuilder HiFi DNA Assembly o NEB Gibson Assembly. ¿En qué se diferencian los productos? R: NEBuilder HiFi DNA Assembly ofrece varias ventajas sobre NEB Gibson Assembly. NEBuilder HiFi utiliza una polimerasa patentada de mayor fidelidad, lo que resulta en menos cribado/resecuenciación de constructos y un ensamblaje de alta fidelidad prácticamente sin errores. Esta función también permite usar NEBuilder en ciertas aplicaciones para las que NEB Gibson Assembly no es compatible: NEBuilder HiFi elimina los desajustes en los extremos 5' y 3' y puede usarse en rondas sucesivas de ensamblaje. Esto ahorra tiempo al evitar los largos pasos de amplificación por PCR. NEBuilder HiFi puede unir dos fragmentos ds con un oligonucleótido de ssDNA sintético para una construcción simple y rápida (por ejemplo, inserción de enlazadores o biblioteca de gRNA). Para obtener información y datos más detallados, visite NEBuilderHifi.com. P: ¿Cuáles son las ventajas de este método en comparación con los métodos de clonación tradicionales? R: El ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi permite la inserción de uno o más fragmentos de ADN en prácticamente cualquier posición del vector linealizado y no depende de la presencia de sitios de restricción dentro de una secuencia específica. Por lo tanto, el usuario tiene control total sobre lo que se ensambla y se puede evitar la inserción de secuencias adicionales no deseadas, a menudo utilizadas para facilitar la manipulación de múltiples secuencias de ADN. Además, el método de ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi es rápido, en comparación con la clonación estándar basada en enzimas de restricción. Por último, se puede unir un mayor número de fragmentos de ADN en una sola reacción con mayor eficiencia que los métodos convencionales. P: ¿Existen diferencias entre NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix y NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit? R: El NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix en ambos productos es el mismo. El NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit incluye E. coli químicamente competente NEB 5-alfa adicional. P: ¿Cuál es la diferencia entre NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix/DNA Assembly Cloning kit/Bundle for Large Fragments kit y el NEB Gibson Assembly Master Mix/Cloning Kit actual? R: El NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix utiliza una polimerasa de alta fidelidad con mayor precisión. Si bien los protocolos para estos kits son similares, los productos ensamblados de NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix y NEBuilder HiFi Cloning Kit generalmente darán como resultado más colonias. Cuando es necesario ensamblar ADN de gran tamaño (> 10 kb) o fragmentos múltiples (4+), aumentar la región de solapamiento a 30 pb mejora la eficiencia del ensamblaje y la transformación. Además, los productos NEBuilder no requieren el pago de licencias por parte de NEB. P: ¿Cuál es el fragmento individual más grande que se ha ensamblado con la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi? R: La mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi se ha utilizado para clonar un constructo de 22,7 kb de longitud. Para productos ensamblados de más de 15 kb, NEB recomienda NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency, NEB n.° C3019), que se incluye en el paquete NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle para fragmentos grandes (NEB n.° E2623). Como alternativa, puede utilizar NEB 10-beta Electrocompetent E. coli (NEB n.° C3020). P: ¿Cuántos fragmentos de ADN se pueden ensamblar en una reacción? R: El número de segmentos de ADN que se pueden ensamblar en una reacción depende de la longitud y la secuencia de los fragmentos. NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix se ha utilizado para ensamblar eficientemente hasta once insertos de 0,4 kb en un vector a la vez. Sin embargo, recomendamos ensamblar cinco insertos o menos en un vector en una sola reacción para producir un clon con el inserto correcto. Se puede utilizar una estrategia de ensamblaje secuencial si no se pueden ensamblar todos los fragmentos en una sola reacción. Como alternativa, se puede considerar el ensamblaje Golden Gate para ensamblajes de más de 6 fragmentos. P: ¿Es este método aplicable al ensamblaje de secuencias repetitivas? R: Sí. Sin embargo, es necesario asegurar que cada fragmento de ADN incluya una superposición única para que las secuencias puedan anelalizarse y organizarse correctamente. La secuencia repetitiva también se puede internalizar en la primera etapa de una estrategia de ensamblaje de dos etapas. Si es inevitable tener secuencias repetitivas en los extremos de cada fragmento, se puede producir el ensamblaje de ADN correcto, aunque con menor eficiencia que otros ensamblajes no deseados. Como alternativa, considere el ensamblaje Golden Gate para ensamblajes que contienen secuencias repetitivas. P: ¿Cuáles son los solapamientos más cortos que se pueden usar con este método de ensamblaje? R: Se ha logrado un ensamblaje productivo para fragmentos de ADN con tan solo un solapamiento de 12 pb; sin embargo, depende del contenido de GC del solapamiento. Recomendamos usar solapamientos de al menos 15 pb, o más, para el ensamblaje de dsADN con una Tm ≥ 48 °C (par AT = 2 °C y par GC = 4 °C). Aumentar la longitud del solapamiento entre fragmentos también reduce la cantidad de ADN necesaria para el ensamblaje. P: ¿Cuáles son los solapamientos más largos que se pueden usar con este método? R: Tanto la cantidad de exonucleasa 5' en la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi como un tiempo de reacción de ensamblaje de 15 minutos se han optimizado para el ensamblaje de moléculas de ADN con solapamientos ≤ 20 pb. Si el tiempo de reacción de ensamblaje se incrementa a 60 minutos, se pueden usar solapamientos de hasta 30 pb con la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi. P: ¿Se pueden ensamblar fragmentos de dsADN de ≤ 200 pb con este método? R: Sí. Para obtener resultados óptimos, use estos fragmentos en un exceso ≥ 5 veces mayor. P: ¿Se pueden ensamblar múltiples oligonucleótidos de ssADN con fragmentos de dsADN? R: Sí. Sin embargo, se debe determinar la concentración óptima de cada oligonucleótido. Como punto de partida, recomendamos usar 45 nM de cada oligonucleótido que sea menor o igual a doce oligonucleótidos de 60 bases que contengan solapamientos de 30 bases. Para obtener más información, descargue la nota de aplicación, Construcción de un vector de expresión sgRNA-Cas9 mediante puentes de oligonucleótidos de ADN monocatenario de fragmentos de ADN bicatenario. P: ¿Se pueden usar tiempos de incubación más largos o más cortos? R: Sí. Para ensamblar 2-3 fragmentos, son suficientes tiempos de incubación de 15 minutos. Para ensamblar de 4 a 6 fragmentos, se recomiendan tiempos de incubación de 60 minutos. Generalmente, no se recomiendan tiempos de reacción inferiores a 15 minutos. Se ha demostrado que los tiempos de incubación prolongados (hasta 4 horas) mejoran la eficiencia del ensamblaje en algunos casos. No incube la reacción durante la noche. P: ¿Funcionará la reacción a otras temperaturas? R: La reacción se ha optimizado a 50 °C, pero se ha demostrado que funciona entre 40 °C y 50 °C. P: ¿Es necesario purificar los productos de PCR al realizar ensamblajes de ADN utilizando NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix o Gibson Assembly Master Mix? R: Generalmente, no es necesaria la purificación de los productos de PCR. Puede usar productos de PCR sin purificar directamente, siempre que el volumen total de productos de PCR sin purificar en la reacción de ensamblaje sea del 20 % o menos. Si se utilizan mayores cantidades de productos de PCR, recomendamos el uso de un kit de limpieza basado en columna (Monarch PCR & DNA Cleanup Kit, NEB n.º T1030). En caso de que se amplifiquen múltiples fragmentos o se observe la presencia de dímeros de cebadores, recomendamos optimizar la PCR para obtener los mejores resultados. P: ¿Es necesario inactivar las enzimas de restricción después de la digestión del vector? R: La inactivación de las endonucleasas de restricción generalmente no es necesaria, pero en algunos casos puede aumentar la eficiencia de la transformación. Si el inserto y el producto final ensamblado también contienen el sitio de restricción utilizado para linealizar el vector, es necesario inactivar la enzima de restricción por calor o purificar el vector cortado si la inactivación por calor no es posible. P: Me gustaría producir fragmentos de dsADN superpuestos mediante PCR. ¿Necesito usar cebadores de PCR purificados por PAGE o HPLC? R: No. Se pueden usar cebadores estándar desalados. P: Me gustaría ensamblar oligonucleótidos de ssADN en fragmentos de dsADN. ¿Necesito usar oligonucleótidos purificados por PAGE o HPLC? R: No. Se pueden usar cebadores estándar desalados. Para obtener más información, descargue la nota de aplicación "Construcción de un vector de expresión sgRNA-Cas9 mediante puentes de oligonucleótidos de ADN monocatenario con fragmentos de ADN bicatenario". P: ¿Puedo usar una superposición de 15 nt compuesta íntegramente por repeticiones de His-tag (es decir, CACCACCACCACCAC)? R: No, debe flanquear la secuencia de His-tag a ambos lados con al menos 2 nucleótidos que no formen parte de la secuencia repetitiva de His-tag. Alternativamente, intercale los codones CAC y CAT his para interrumpir esta secuencia repetitiva. Debe evitar las secuencias repetidas al final de una superposición. P: ¿Puedo amplificar por PCR el producto ensamblado? R: Sí. La molécula de ADN ensamblada está unida covalentemente y puede amplificarse por PCR. Además, si el producto final es una molécula de ADN circular cerrada, puede usarse como plantilla en la amplificación por círculo rodante (RCA). P: La reacción de control positivo de NEBuilder no genera colonias. ¿Por qué? R: Nuestras pruebas indican que la elección de células competentes es crucial. Recomendamos el uso de células químicamente competentes de alta eficiencia, como NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) (NEB #C2987). Transforme las células competentes con el control de ADN pUC19 para confirmar su viabilidad. P: ¿Qué debo hacer si mi reacción de ensamblaje no produce colonias, solo unas pocas colonias o clones con un tamaño de inserto incorrecto tras la transformación en E. coli? R: Ensamble y transforme el control positivo proporcionado con el kit de clonación/mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi. El ensamblaje exitoso de un control positivo demostrará que la mezcla de ensamblaje es funcional y que las condiciones de transformación son adecuadas. Analice la reacción en un gel de agarosa. Una reacción de ensamblaje eficiente mostrará productos ensamblados del tamaño correcto y la desaparición de fragmentos. Compruebe el diseño del cebador de los fragmentos de ADN superpuestos para garantizar que haya suficiente superposición para facilitar el ensamblaje. Considere si el inserto clonado puede ser tóxico para E. coli y utilice un vector de bajo número de copias, como un BAC. P: ¿Cómo puedo reducir el número de colonias de fondo solo con vector? R: Para reducir significativamente el fondo de colonias no deseadas solo con vector, el vector debe ser un producto de PCR en lugar de un fragmento de restricción. Si el fondo persiste, el vector amplificado por PCR puede tratarse con DpnI para eliminar el arrastre de la plantilla, si corresponde, extraído de un gel de agarosa después de la electroforesis. P: ¿Qué tipo de células competentes son adecuadas para la transformación de construcciones de ADN creadas con NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix? R: Las construcciones de ADN resultantes son compatibles con la mayoría de las células competentes de E. coli. NEB recomienda usar NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C2987). Si los productos ensamblados tienen más de 15 kb, NEB recomienda usar NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C3019) o NEB 10-beta Electrocompetent E. coli (NEB #C3020). Si los genes ensamblados contienen secuencias repetitivas, se debe utilizar la E. coli estable competente NEB (NEB n.° C3040). ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El muestreador de E. coli competente para clonación NEB (NEB n.° C1010) le permite muestrear 4 de nuestras populares cepas químicamente competentes. P: ¿Puedo usar electroporación en lugar de transformación química? R: Sí, pero es necesario diluir el producto de la reacción de ensamblaje de Gibson 3 veces y usar solo 1 μl para la electroporación. Nota: Las células proporcionadas con este kit son químicamente competentes. P: ¿Existen diferencias entre los requisitos para ensamblajes de 2 a 3 fragmentos y de 4 o más? R: Las principales diferencias entre ambos son la longitud de las secuencias superpuestas entre los fragmentos adyacentes y el tiempo de incubación de la reacción de ensamblaje. Se recomienda el protocolo de reacción de ensamblaje de 15 minutos para el ensamblaje de 2 a 3 fragmentos flanqueados por solapamientos de 15 a 20 nt. Se recomienda el protocolo de ensamblaje de 1 hora para el ensamblaje de fragmentos de más de 4, flanqueados por solapamientos de 20 a 30 nt. P: ¿Puedo usar el producto de PCR amplificado a partir de la ADN polimerasa Taq? R: Sí. La base A adicional en el extremo 3' del producto de PCR se eliminará durante el ensamblaje del ADN si se convierte en un residuo desapareado una vez que los fragmentos se hibridan. P: ¿Puedo usar otras herramientas de diseño de cebadores, como SnapGene para el ensamblaje de Gibson, para diseñar cebadores para el ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi? R: Las reglas para el diseño de cebadores son similares tanto para el ensamblaje de Gibson como para el ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi. Cualquier cebador diseñado para el ensamblaje de Gibson funcionará con NEBuilder HiFi. Sin embargo, algunos cebadores que funcionan con NEBuilder HiFi podrían no funcionar con Gibson porque, a diferencia de la mezcla maestra para ensamblaje de Gibson, la mezcla maestra para ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi puede eliminar los desapareamientos del extremo 3'. Es posible que las herramientas que diseñan cebadores "Gibson" no permitan el diseño de cebadores que aprovechen esta capacidad de NEBuilder HiFi. Aunque es posible usar otras herramientas, NEB recomienda usar nuestra herramienta gratuita, NEBuilder Assembly Tool, ya que puede diseñar cebadores que consideran los extremos del vector generados por la digestión con enzimas de restricción. P: ¿Tiene alguna sugerencia sobre cómo mejorar el ensamblaje del ADN al usar ADN sintetizado (p. ej., gBlocks) y NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (E2621/E5520/E2623)? R: Introducir un paso de amplificación en el flujo de trabajo puede producir mejores resultados. La amplificación de los gBlocks mediante una polimerasa de alta fidelidad como Q5 (M0491S) como primer paso en el flujo de trabajo de ensamblaje puede aumentar la cantidad de ADN disponible para el ensamblaje y, en consecuencia, el número de plásmidos correctamente ensamblados. P: Quiero unir dos fragmentos, pero la secuencia de solapamiento está a 500 pb del final del vector. ¿Puede NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix lograr esto? R: NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix se puede usar para unir un fragmento de ADN a 20 pb del final del vector. Para unir un fragmento a mayor distancia del extremo, complemente la mezcla maestra con 0,1-0,3 unidades de exonucleasa T5. Diluya la exonucleasa T5 (M0663, 10 unidades/ul) en tampón rCutSmart 1X. A continuación, añada la enzima diluida a la reacción de ensamblaje junto con la mezcla maestra de ADN 2X. Incube a 50 °C durante 1 hora y luego transforme en células competentes de alta eficiencia, como NEB 5-alfa o NEB 10-beta. La exonucleasa T5 debe diluirse inmediatamente antes de su uso y no se puede almacenar en tampón rCutSmart 1X. P: ¿Cómo puedo mejorar la eficiencia de reacciones de ensamblaje muy complejas al utilizar la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi? R: Una reacción de ensamblaje muy compleja puede contener 6 o más fragmentos de ADN, incluidos productos de digestión con enzimas de restricción sin purificar. Por ejemplo, puede que esté usando un inserto que se ha cortado de un plásmido pero no se ha purificado, de modo que hay dos fragmentos de ADN: el inserto y el vector original. Solo el fragmento del inserto se ensamblará con otros fragmentos. La eficiencia de estas reacciones de ensamblaje muy complejas se puede aumentar incubando las reacciones a 45 °C en lugar de 50 °C. Recomendamos usar 0,05 pmol de cada plásmido digerido, con un máximo de 0,5 pmol de ADN en la reacción. P: ¿Puede la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder® HiFi eliminar los desajustes de los extremos 3′ y 5′? R: Sí, NEB HiFi puede eliminar estos desajustes hasta 10 pb del extremo, lo que permite que los extremos del ADN se anillan sin el saliente. P: ¿Cómo deben prepararse los fragmentos para el ensamblaje utilizando NEBuilder HiFi? R: Los fragmentos se pueden preparar mediante los siguientes métodos: Los fragmentos generados por PCR se pueden limpiar con la columna Monarch PCR o el kit Exo-CIP Rapid PCR Cleanup si la pureza del amplicón es superior al 95 %. Si se utilizó ADN plasmídico como plantilla durante la PCR, se puede eliminar mediante tratamiento con DpnI si es necesario. Si se observan multibandas, recomendamos optimizar la PCR. Si esto no es posible, se recomienda la purificación en gel. La extracción en gel puede introducir tiocianato de guanidina (del tampón de disolución), lo que puede reducir la eficiencia de la reacción de ensamblaje. Para minimizar esta contaminación, recorte el corte de gel para poder utilizar una menor cantidad de tampón de disolución. Se puede realizar la digestión con enzimas de restricción de un plásmido, seguida de inactivación por calor o purificación en columna. Los fragmentos comerciales se pueden resuspender en agua sin nucleasas o tampón TE y utilizar directamente en la reacción de ensamblaje. P: Me gustaría miniaturizar el ensamblaje de ADN con la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi utilizando el manipulador de líquidos Labcyte Echo. ¿Tiene alguna información que pueda consultar para ayudarme a automatizar el ensamblaje de ADN? R: Las siguientes referencias de Labcyte están disponibles: Nota de aplicación: Ensamblaje de ADN multipieza miniaturizado Nota técnica: Ensamblaje de ADN modular de PIK3CA mediante transferencia acústica de líquido en volúmenes de nanolitros Nota técnica: Ensamblaje de ADN a escala de nanolitros utilizando el kit de clonación NEBuilder HiFi P: ¿Cómo afecta la longitud de superposición a la eficiencia del ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi? R: Las superposiciones más largas (20-30 pares de bases) aumentan la eficiencia del ensamblaje. Se ensamblaron cuatro fragmentos (~20 fmol) con una superposición de 15 o 20 pb utilizando la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi (NEB n.º E2621) a 50 °C durante 60 minutos para crear un vector pUC19. 2 µl de la mezcla ensamblada se transformaron en E. coli competente NEB 5-alfa (NEB n.º C2987) y se extendieron en una placa LB/Amp que contenía IPTG y X-gal. Se contaron las colonias azules que indicaron un ensamblaje correcto. La mezcla de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi es más eficiente con una superposición de 20 pb que con una de 15 pb. P: ¿Qué resistencia a los antibióticos está codificada en el control positivo de NEBuilder (control de ensamblaje)? R: El control positivo de NEBuilder es un inserto único en un plásmido pUC19 resistente a la ampicilina. Si su mezcla de ensamblaje funciona, obtendrá colonias en una placa de ampicilina utilizando el control positivo de NEBuilder. P: Utilizo el kit de mutagénesis dirigida Q5 para introducir mutaciones individuales. ¿Cómo puedo introducir múltiples mutaciones? R: NEB® ha desarrollado un protocolo que utiliza la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi para simplificar la construcción de múltiples mutagénesis dirigidas. La técnica implica el diseño de cebadores flanqueadores complementarios para alinear los fragmentos. Esta nota de aplicación describe el uso de la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi para generar múltiples mutagénesis dirigidas simultáneamente. Recomendamos superposiciones de 18-20 nt, pero la longitud de los cebadores puede variar. Los cebadores se superponen completamente, como se ilustra a continuación. El objetivo es lograr Ta equilibradas para los pares de cebadores. Las mutaciones se ubican en el centro del cebador. Debe haber suficientes bases a ambos lados, y sobre todo en el extremo 3' de la mutación, para que el cebador se asocie correctamente al molde.