Kit LunaScript® RT SuperMix, E3010S, New England Biolabs

Kit LunaScript RT SuperMix ( Categorías relacionadas Aplicaciones de Luna® qPCR y RT-qPCR qPCR y RT-qPCR, RT-qPCR de dos pasos, Transcripción inversa (síntesis de ADNc), Preguntas frecuentes P: ¿Puedo usar muestras de ARN purificadas de diferentes condiciones de almacenamiento, como RNALater, en mis reacciones de síntesis de ADNc de LunaScript®? R: En general, las muestras de ARN purificadas de diferentes fuentes funcionan bien con los productos LunaScript. Normalmente recomendamos la purificación de ARN mediante métodos basados ​​en columnas (p. ej., Monarch® RNA Miniprep Kit (NEB n.º T2010S)). P: ¿Puedo añadir cebadores específicos de genes a mi reacción de síntesis de ADNc de LunaScript®? R: LunaScript RT SuperMix está optimizado para la detección mediante RT-qPCR de dos pasos y contiene todo lo necesario para la síntesis de ADNc, incluido el cebador dT y el hexámero aleatorio. Si se desean cebadores alternativos o específicos de genes para la síntesis de ADNc, el kit LunaScript RT Master Mix (sin cebador) es más Adecuado. LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) (NEB n.° 3025) es idéntico a LunaScript RT SuperMix, pero sin cebadores. P: ¿Puedo preparar mi reacción de síntesis de ADNc a temperatura ambiente con LunaScript® RT SuperMix? R: Sí. Las reacciones de síntesis de ADNc de LunaScript se pueden preparar a temperatura ambiente. P: ¿Puedo usar un tiempo de incubación más corto para mi reacción de síntesis de ADNc con LunaScript® RT SuperMix? R: Sí. Para muchas dianas, se pueden usar tiempos de incubación de tan solo 2 minutos para el paso de síntesis de ADNc a 55 °C. Sin embargo, se recomiendan condiciones de ciclado estándar como punto de partida, y pueden ser necesarias para ensayos complejos o con muestras de ARN que contengan impurezas. P: ¿Puedo usar los productos de ADNc de LunaScript® directamente en qPCR? ¿Qué cantidad puedo usar para la detección en una reacción de qPCR? R: El producto de ADNc se puede usar directamente en la reacción de qPCR. En general, recomendamos 1 μl de producto de ADNc en una detección de qPCR de 20 μl. Cuando sea útil, hasta el 20 % del volumen de qPCR puede ser producto de ADNc sin diluir (p. ej., 4 μl de producto de ADNc en una reacción de qPCR de 20 μl). P: ¿Cuánta plantilla de ARN debo usar en mis reacciones de síntesis de ADNc de LunaScript®? R: Las mezclas LunaScript funcionan bien con plantillas de ARN purificadas, incluyendo ARN total, ARNm y muestras de transcripciones in vitro. Cantidad en una reacción de 20 μl ARN total ≤ 1 μg Poli(A)-ARN ≤ 1 μg Transcripciones in vitro 100 ng P: ¿Cómo debo almacenar los productos de ADNc de LunaScript®? R: El producto de ADNc se puede almacenar a 4 °C para su uso a corto plazo. Para el almacenamiento a largo plazo, debe almacenarse a -20 °C o -80 °C. P: ¿Cómo debo elegir entre una RT-qPCR de un solo paso o ¿Un enfoque de RT-qPCR de dos pasos? R: Existen dos métodos para cuantificar muestras de ARN: RT-qPCR de un paso y RT-qPCR de dos pasos. En ambos casos, el ARN se transcribe primero de forma inversa a ADNc, que luego se utiliza como molde para la amplificación por qPCR. La transcripción inversa puede realizarse por separado de la qPCR (es decir, RT-qPCR de dos pasos) o directamente en la mezcla de qPCR (es decir, RT-qPCR de un paso). Los flujos de trabajo de un paso se prefieren comúnmente en ensayos de diagnóstico molecular, donde las entradas de muestras pueden ser limitadas o se examinan numerosas muestras. La RT-qPCR de dos pasos se prefiere cuando se realizarán múltiples interrogaciones del mismo material de partida o cuando se requiera el archivo de ADNc. Para más detalles, consulte "Elección de RT-qPCR de un paso o RT-qPCR de dos pasos". P: ¿Debo incluir una reacción de control sin transcriptasa inversa (RT) al configurar mi reacción de síntesis de ADNc? R: Sí. Cuando esté presente, El ADN genómico o los productos de arrastre pueden interferir con la cuantificación precisa del ARN, especialmente en dianas con un bajo número de copias. Por lo tanto, es importante realizar las reacciones de control No-RT adecuadas para tener en cuenta estos efectos. Además, no se deben configurar reacciones de control sin plantilla (NTC) para demostrar que las reacciones positivas son significativas. Consulte el kit LunaScript RT SuperMix (NEB n.° E3010) si necesita una mezcla de control No-RT. P: ¿Qué reactivos de qPCR recomiendan para la detección de productos de ADNc? R: Los productos de ADNc generados con las mezclas LunaScript® se han evaluado ampliamente en qPCR utilizando la mezcla maestra Luna® Universal qPCR (NEB n.° M3003) y la mezcla maestra Luna Universal Probe qPCR (NEB n.° M3004). En combinación, estos productos proporcionan un flujo de trabajo de RT-qPCR de dos pasos con excelente sensibilidad y cuantificación lineal y precisa. Además, LunaScript es compatible con otras mezclas comerciales importantes de qPCR. P: ¿Qué temperatura debo usar para mi reacción de síntesis de ADNc de LunaScript®? R: La transcriptasa inversa termoestable Luna® facilita una síntesis eficiente de ADNc a temperaturas elevadas en comparación con la RT MMLV. Para la mayoría de las dianas, la síntesis de ADNc puede lograrse con una incubación de 10 minutos a 55 °C. Para moldes difíciles, la temperatura de síntesis de ADNc puede aumentarse hasta 65 °C. P: ¿Por qué obtengo bajos rendimientos de ADNc? R: Existen varias causas para un bajo rendimiento de ADNc. Aquí hay algunas sugerencias para mejorar el rendimiento: Verifique la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante o BioAnalyzer (Agilent). Un ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. El ARN debe tener una relación mínima A260/A280 de 1,7 o un número RIN superior a 8. La precipitación con etanol seguida de un lavado con etanol al 70 % puede eliminar contaminantes como EDTA y guanidinio. La precipitación con cloruro de litio puede eliminar polisacáridos. La purificación de ARN mediante kits de extracción de ARN o extracción con fenol/cloroformo puede eliminar proteínas contaminantes como las proteasas. Aumente la cantidad de ARN utilizado, especialmente para ARN poco abundante. P: ¿El colorante azul del LunaScript® RT SuperMix interferirá con la detección? R: Los productos LunaScript contienen un colorante de referencia visual inerte que le da a la mezcla un color azul claro. Esta apariencia coloreada facilita el seguimiento de la configuración de la reacción, identificando la presencia o ausencia, así como las diferencias de volumen, de las reacciones de ADNc en tubos, puntas de pipeta y reacciones de qPCR posteriores. El colorante azul se ha evaluado ampliamente en experimentos de síntesis de ADNc y qPCR, y no se ha observado que inhiba ni interfiera con la detección de ARN. P: ¿Cómo elijo entre los kits de síntesis de ADNc de primera cadena de NEB? R: La Tabla 1 destaca las principales ventajas y aplicaciones de los kits de síntesis de ADNc de primera cadena de NEB. Kits de síntesis de ADNc: Kit LunaScript® RT SuperMix (NEB n.° E3010) Kit LunaScript RT Master Mix (Sin cebador) (NEB n.° E3025) Kit de síntesis de ADNc de primera hebra ProtoScript® II (NEB n.° E6560) Componentes LunaScript RT SuperMix (5X)* Mezcla de control sin RT (5X)* Agua sin nucleasas *Ambas mezclas contienen hexámero y d(T)10 LunaScript RT Master Mix (sin cebador) (5X) Mezcla de control sin RT (sin cebador) (5X) Agua sin nucleasas ProtoScript II Enzyme Mix (10X) ProtoScript II Reaction Mix (2X) Oligo d(T)23VN (50 µM) Mezcla de cebador aleatorio (60 µM) Agua sin nucleasas Formato Aplicación recomendada Cebadores Incubación Para detección por RT-qPCR de 2 pasos Hexámero y d(T)10 incluidos 25 °C 2 min; 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Para RT-qPCR de 2 pasos detección Mezcla de cebadores aleatorios 25 °C 2 min; 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Para síntesis general de ADNc d(T)23VN o cebadores específicos del gen 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Mezcla de cebadores aleatorios 25 °C 2 min; 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Para síntesis general de ADNc d(T)23VN o cebadores específicos del gen 42 °C 60 min; 80 °C 5 min Mezcla de cebadores aleatorios 25 °C 5 min; 42 °C 60 min; 80 °C 5 min Ventajas ✓ Supermix ✓ Protocolo corto ✓ Un indicador de seguimiento visible ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Mayor volumen de entrada de ARN ✓ Elección flexible de cebadores ✓ Protocolo corto ✓ Un indicador de seguimiento visible ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Mayor volumen de entrada de ARN ✓ Elección flexible de cebadores ✓ Todo incluido Siga el árbol de decisiones a continuación para elegir el kit de síntesis de ADNc de primera cadena según sus aplicaciones posteriores. Figura 1. LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) admite numerosas aplicaciones. Al agregar diferentes cebadores, incluidos Random Primer Mix, d(T)23VN y hexámeros aleatorios, el ADNc producido por LunaScript RT Master Mix puede ser ideal para aplicaciones posteriores, como la detección por RT-qPCR, RT-PCR y estudios de ARN-seq. P: Al usar productos de ADNc de LunaScript en PCR posterior (es decir, RT-PCR de dos pasos), ¿qué volúmenes y productos de PCR se pueden usar? R: Los productos de ADNc de las reacciones de LunaScript son compatibles con muchos reactivos de PCR. Por lo general, recomendamos OneTaq 2X Master Mix (NEB n.º M0482 o NEB n.º M0485) para la detección por PCR de hasta 5 kb, Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494) para una máxima fidelidad, y LongAmp Taq 2X Master Mix (NEB #M0287) para obtener altos rendimientos a partir de productos más largos. Dependiendo de los objetivos/cebadores, la entrada óptima de ADNc puede variar y debe optimizarse, pero normalmente recomendamos 1 μl de la reacción de ADNc como entrada en una PCR de 25 μl. Cuando sea útil, se puede añadir hasta un 20 % del volumen de PCR (p. ej., 5 μl de producto de ADNc en una PCR de 25 μl). P: ¿Puedo usar LunaScript RT SuperMix en flujos de trabajo de secuenciación de ARN? R: LunaScript RT SuperMix contiene hexámeros aleatorios y oligonucleótidos dT, lo que ofrece una cobertura uniforme de las plantillas de ARN. Se ha utilizado en la secuenciación genómica del SARS-CoV-2 siguiendo diversos protocolos, incluidos los de la red ARTIC. Hay soluciones completamente preparadas disponibles en estos productos NEB: NEB #E7660, NEB# E7658, NEB #E7560. P: ¿Cómo elijo entre el kit LunaScript® RT SuperMix y los kits ProtoScript de síntesis de ADNc de primera cadena? R: Los kits de síntesis de ADNc de primera cadena contienen diferentes transcriptasas inversas, cuyas principales diferencias residen en sus aplicaciones principales, formato y temperatura de reacción. A continuación, se presenta un resumen de nuestros tres kits de síntesis de ADNc de primera cadena. Producto: Kit LunaScript RT SuperMix (E3010), Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript II (E6560), Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript (E6300), Transcriptasa inversa RT Luna, Transcriptasa inversa ProtoScript II, Transcriptasa inversa M-MuLV. Formato: Supermix, Mezcla de reacción, mezcla de enzimas, cebador. Mezcla de reacción, mezcla de enzimas, cebador. Aplicación principal: RT-qPCR de dos pasos. RT-PCR de punto final hasta 10 kb. RT-PCR de punto final hasta 5 kb. Aplicación secundaria: RT-PCR de punto final hasta 3 kb. RT-qPCR de dos pasos. Temperatura de reacción de RT-qPCR Hasta 65 °C (55 °C óptimo) Hasta 48 °C (42 °C óptimo) Hasta 45 °C (42 °C óptimo) Entrada de ARN 1 μg a 1 pg 1 μg a 1 pg 1 μg a 1 pg Incubación 25 °C 2 min, 55 °C 10 min, 95 °C 1 min 25 °C 5 min, 42 °C 60 min, 85 °C 5 min 25 °C 5 min, 42 °C 60 min, 85 °C 5 min Características adicionales Colorante de seguimiento azul, protocolo rápido de 13 min P: ¿Puedo usar un tiempo de incubación más corto para mi reacción de síntesis de ADNc cuando uso la mezcla maestra LunaScript® RT (sin cebador)? ¿Una incubación más prolongada aumenta el rendimiento del ADNc? R: En las condiciones recomendadas (55 °C durante 10 min), la mezcla maestra LunaScript La mezcla maestra RT (sin cebadores) puede generar ADNc de hasta 9 kb. En algunos objetivos/flujos de trabajo, los productos se pueden detectar después de 5 minutos. En algunos casos, una incubación más prolongada (hasta 60 minutos) puede aumentar la producción de ADNc. Se pueden realizar experimentos piloto para determinar el tiempo de incubación óptimo. P: ¿Cómo elijo entre la transcriptasa inversa Induro y los diferentes productos LunaScript y ProtoScript? R: La transcriptasa inversa Induro es una transcriptasa inversa codificada por intrones del grupo II, útil para la síntesis de ADNc a partir de transcripciones largas, ARN con estructuras secundarias fuertes y muestras de ARN con inhibidores. Por el contrario, los reactivos LunaScript son mezclas maestras. El kit LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) (NEB n.° E3025) es adecuado para la síntesis general de ADNc. Los productos LunaScript RT SuperMix (NEB n.° E3010/M3010) están optimizados para flujos de trabajo de RT-qPCR de dos pasos donde solo se requieren productos cortos de ADNc. LunaScript RT SuperMix también se incluye en el flujo de trabajo de secuenciación ARTIC SARS-CoV-2. Esta tabla describe las aplicaciones y características de cada una. RT codificada por intrones Productos de RT retroviral Transcriptasa inversa Induro™ (NEB #M0681) Kit LunaScript® RT SuperMix (NEB #E3010) LunaScript RT SuperMix (NEB #M3010) Kit LunaScript RT Master Mix (NEB #E3025) Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript® II (NEB #E6560) Aplicaciones Síntesis de ADNc largo Muestras de ARN impuro Aplicaciones de ARN-seq (p. ej., secuenciación directa de ARN, secuenciación de ADNc de lectura larga, secuenciación de ARNt Aplicaciones Detección RT-qPCR de 2 pasos] Flujo de trabajo de ARN-seq Aplicaciones Flujo de trabajo de ARN-seq Detección RT-qPCR de 2 pasos Síntesis general de ADNc Detección RT-PCR de 2 pasos Aplicaciones Síntesis general de ADNc Flujo de trabajo de RNA-seq Detección por RT-PCR en 2 pasos ✓ Protocolo corto ✓ Elección flexible de cebadores, dNTP modificados ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Supermix ✓ Protocolo corto ✓ Colorante de seguimiento ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Elección flexible de cebadores ✓ Protocolo corto ✓ Colorante de seguimiento ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Elección flexible de cebadores ✓ El formato del kit incluye todos los componentes necesarios P: ¿Cómo sé si mi ARN molde es de buena calidad? R: El ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis de ADNc de longitud completa. Una relación de absorbancia en A260/A280 superior a 1,7 o un número RIN superior a 8 en un BioAnalyzer generalmente indica ARN de alta calidad.