New England Biolabs, E3019S, Kit de ensayo multiplexado Luna® SARS-CoV-2 RT-qPCR

El tamaño grande de este producto (NEB #E3019L) se suspendió el 15 de diciembre de 2024. El tamaño de paquete pequeño seguirá estando disponible. Categorías relacionadas Luna® qPCR y RT-qPCR,, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación Aplicaciones qPCR y RT-qPCR basadas en sonda,, qPCR y RT-qPCR,, RT-qPCR de dos pasos Preguntas frecuentes P: ¿Las diferentes variantes del SARS-CoV-2 afectan la eficacia del kit de ensayo multiplex Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR? R: Actualización de Omicron El ensayo Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR (NEB #E3019) es un ensayo multiplex RUO basado en los genes N1 y N2 del SARS-CoV-2 diseñados por los CDC de EE. UU. La nueva variante de COVID-19, Omicron, contiene una mutación puntual en una región del gen N que es el objetivo de la sonda N1 (C28311U). Las pruebas directas de ARN purificado que representa tanto el tipo salvaje (Wuhan) como la plantilla N1 mutante del SARS-CoV-2 (Omicron) dieron como resultado resultados sustancialmente equivalentes y una detección del 100 % de ambas muestras a 10 copias por reacción (27/27 réplicas analizadas). Además, una subpoblación de la variante Omicron BA.5 contiene una mutación puntual adicional en el extremo 3′ de la sonda N1 (A28330G). Las pruebas de ARN purificado que representa tanto el tipo salvaje (Wuhan) como la plantilla mutante BA.5 (C28311U, A28330G) también dieron como resultado resultados sustancialmente equivalentes. Otras variantes NEB ha desarrollado una herramienta web (Primer Monitor) para monitorear continuamente los conjuntos de cebadores registrados para detectar variantes superpuestas en secuencias de GISAID. Usando esta herramienta, identificamos una variante prominente de algunos países con un SNP cerca del extremo 3' del cebador directo 2019-nCoV-2_N2 incluido en el kit Luna, que detecta los objetivos CDC SARS-CoV-2 N1, N2 y el gen RNasa P humano con modificaciones (haga clic para obtener más detalles) (A). Para evaluar el impacto de este SNP en la detección del objetivo N2, preparamos dos fragmentos de ARN del gen N que contenían los objetivos N2 de tipo salvaje y mutante, respectivamente, mediante transcripción in vitro y los cuantificamos utilizando el SARS-CoV-2 RNA Control 2 de Twist Bioscience. Usando el conjunto de cebador/sonda incluido en el kit Luna, observamos un retraso promedio de 4,2 Cq para el objetivo N2 mutante (B). El límite de detección (LOD) para el objetivo N2 mutante fue de 25 copias/reacción. Aunque todas las reacciones que contenían 10 copias del ARN mutante generaron una señal de amplificación, solo 11 de 24 tuvieron un Cq ≤ 40, el punto de corte para la detección (C). P: ¿Qué componentes se incluyen en el kit de ensayo multiplex Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR? R: El kit de ensayo multiplex Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR contiene todos los componentes necesarios para realizar ensayos multiplex RT-qPCR como se especifica en los detalles a continuación. La mezcla maestra Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X con UDG (NEB n.º M3019) se suministra a una concentración 4X y contiene todos los componentes necesarios para One-Step RT-qPCR. También está formulada con un colorante de referencia pasivo único que es compatible con una variedad de plataformas de instrumentos, dUTP/UDG para la prevención del arrastre y un colorante visible no fluorescente para monitorear la configuración de la reacción. La mezcla de cebadores/sondas del SARS-CoV-2 que se incluye en este kit contiene cebadores y sondas específicos para dos regiones del gen N del virus SARS-CoV-2 [basado en secuencias proporcionadas por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC)]. Sin embargo, se han modificado para contener fluoróforos diferentes (N1, HEX; N2, FAM) para permitir la observación simultánea en dos canales diferentes de un instrumento en tiempo real. Para garantizar la integridad del material de entrada y la ausencia de inhibición, la mezcla de cebadores también incluye un conjunto de cebadores y sondas de control interno (CI), diseñado para amplificar el gen RNaseP humano. El cebador inverso de esta diana se ha modificado a partir del diseño de los CDC para dirigirse a un límite exón-exón y reducir la amplificación de fondo procedente de un posible ADN genómico contaminante. La amplificación del CI se observa en el canal Cy5. También se incluye una plantilla de control positivo (PC) (gen N del SARS-CoV-2 clonado en un plásmido). P: ¿Cuántas muestras de prueba se pueden analizar en una placa de 96 pocillos? R: El kit de ensayo multiplex Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR permite la detección simultánea de dos regiones del gen N del virus SARS-CoV-2, además de un control interno. Recomendamos ejecutar un control positivo y uno negativo por placa, lo que permite alojar hasta 94 muestras de prueba en una placa de 96 pocillos. P: ¿El kit de ensayo multiplex Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR permite prevenir la contaminación cruzada/reducir la contaminación? R: Sí, el kit incluye la mezcla maestra Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X con UDG (NEB n.° M3019), formulada con una mezcla de dTTP y dUTP. Esto permite la incorporación de dU a los productos de reacción sin sacrificar la eficiencia de la amplificación. La uracilo ADN glicosilasa termolábil antártica (UDG) de la mezcla digiere los productos de RT-qPCR que contienen dU, lo que previene la contaminación por productos de amplificación cruzada. Dado que la RT-qPCR puede generar cantidades significativas de ADN, las mejores prácticas incluyen el uso de diversas estrategias para reducir la contaminación, como el uso de controles ambientales y no abrir los recipientes después de la amplificación. P: ¿Puedo configurar el ensayo de SARS-CoV-2 a temperatura ambiente? R: La mezcla Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X con UDG (NEB n.° M3019) proporcionada en el kit contiene Luna WarmStart® RT emparejado con Hot Start Taq, lo que permite la configuración a temperatura ambiente. Para obtener los mejores resultados, los reactivos del kit deben mantenerse en hielo durante la configuración de la reacción y almacenarse a -20 °C. P: ¿Cuánta muestra se puede agregar a la reacción como entrada para el ensayo de SARS-CoV-2? R: Para ensayos de 96 pocillos, generalmente recomendamos de 2 a 10 μl de ácido nucleico extraído en una reacción de 20 μl para obtener mejores resultados. Para ensayos manuales de 384 pocillos, recomendamos hasta 5 μl de ácido nucleico extraído en una reacción de 10 μl. En algunos flujos de trabajo de 384 pocillos, también se pueden usar reacciones de 5 μl (hasta 2 μl de entrada de muestra). P: ¿Qué dianas detecta la mezcla de cebadores/sondas para el SARS-CoV-2? ¿Cómo se eligieron estos cebadores? R: La mezcla de cebadores/sondas para el SARS-CoV-2 que se incluye en este kit contiene cebadores y sondas específicos para dos regiones del gen N del virus del SARS-CoV-2 (según las secuencias proporcionadas por los CDC). Sin embargo, se han modificado para que contengan fluoróforos diferentes (N1, HEX; N2, FAM) para permitir la observación simultánea en dos canales diferentes de un instrumento en tiempo real. Para garantizar la integridad del material de entrada y la ausencia de inhibición, la mezcla de cebadores también incluye un conjunto optimizado de cebadores y sondas de control interno (CI), diseñado para amplificar el gen de la ARNasa P humana. La amplificación del CI se observa en el canal Cy5. P: ¿La secuencia del conjunto de cebadores/sondas de la ARNasa P es la misma que la de los CDC? R: El cebador inverso de esta diana se ha modificado a partir del diseño de los CDC para que se dirija a un límite exón-exón y así reducir la amplificación de fondo por posible ADN genómico contaminante. P: ¿Qué es el control positivo de SARS-CoV-2 incluido en el kit? R: El control positivo de SARS-CoV-2 (N2117) es un plásmido que contiene el gen N del SARS-CoV-2 (GenBank: MN908947.3). La concentración a 12,5X es de aproximadamente 1 000 000 de copias/µL y cada lote se evalúa mediante qPCR. Tenga en cuenta que no recomendamos el uso de la concentración del control positivo como número absoluto de copias para experimentos cuantitativos. P: ¿Cómo se interpretan los resultados en el kit de ensayo multiplex Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR? A: Muestra 2019-nCoV N1 (HEX) 2019-nCoV N2 (FAM) Control interno (Cy5) Interpretación Control positivo Cq<27 Cq<27 ND Control de calidad aprobado Control negativo ND ND ND Control de calidad aprobado Muestra de prueba ND ND ND Prueba no válida (falla del control interno) Cq<40 ND Cq<40 No concluyente: volver a realizar la prueba ND Cq<40 Cq<40 No concluyente: volver a realizar la prueba Cq<40 Cq<40 Cq<35 o ND* Positivo ND (o Cq>40) ND (o Cq>40) Cq<35 Negativo * Es importante tener en cuenta que cuando una muestra de prueba contiene ARN viral pero solo unas pocas células somáticas o ninguna, es posible observar señales de amplificación de N1 y N2 positivas (Cq < 40) y una señal de ARNasa P negativa (Cq > 35) debido a la competencia del objetivo. Esta muestra debe considerarse positiva. P: ¿Qué tan estable es la mezcla de cebadores del kit de ensayo Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex? R: La mezcla de cebadores/sonda para SARS-CoV-2 (N1/N2/RP) es estable y robusta en condiciones de uso y manipulación estándar. Para obtener los mejores resultados, los materiales deben almacenarse a -20 °C cuando no se utilicen. Las pruebas de estabilidad con hasta 30 ciclos de congelación/descongelación no han mostrado ningún efecto negativo en el rendimiento de la mezcla de cebadores/sonda. P: ¿Qué tipos de muestras/materiales son compatibles con el kit de ensayo Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex? R: Este kit se ha evaluado exhaustivamente utilizando ARN total purificado o ácido nucleico total eluido en agua sin nucleasas o tampones de elución comunes. El material eluido en tampón AVE debe mantenerse en 13 μl (65 % v/v) o menos del volumen de reacción final. El material eluido en TE o un tampón de elución similar debe mantenerse en 5 μl (25 % v/v) o menos del volumen final de la reacción. El material en tampón PBS debe mantenerse en 2 μl (10 % v/v) o menos del tampón final de la reacción. P: ¿Qué instrumentos son compatibles con el kit de ensayo multiplexado Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR? A: Kit de ensayo multiplex RT-qPCR Luna SARS-CoV-2 Instrumentos compatibles Applied BioSystems® 7500 Fast Applied BioSystems® QuantStudio 6/7 Applied BioSystems® QuantStudio 12K Bio-Rad CFX384/CFX96 Bio-Rad IQ™5 Cepheid Smartcycler™/Smartcycler™ II Eppendorf Mastercycler® Qiagen Rotor-Gene® Q/ Rotor-Gene® 6000 Roche LightCycler® 480 Roche LightCycler® 1536 Roche LightCycler® Nano P: ¿Cuáles son las secuencias de los cebadores y las sondas incluidos en el kit? A: Nombre del cebador Cebador directo Sonda de cebador inverso 2019-nCoV_N1 5′ GAC CCC AAA ATC AGC GAA AT 3′ 5′ TCT GGT TAC TGC CAG TTG AAT CTG 3′ 5′ HEX-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-Q 3′ 2019-nCoV_N2 5′ TTA CAA ACA TTG GCC GCA AA 3′ 5′ GCG CGA CAT TCC GAA GAA 3′ 5′ 6-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-Q 3′ RNasa P 5′ AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 3′ 5′ CAA CTG AAT AGC CAA GGT GAG C 3′ 5′ Cy5-TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG-Q 3′ Nota: Q = extintor P: ¿Puedo preparar una placa con antelación? R: Normalmente, recomendamos realizar las reacciones de RT-qPCR lo antes posible después de configurarlas. Sin embargo, según las pruebas realizadas con ARN total purificado en ensayos de 96 pocillos (volumen de reacción de 20 ul), las reacciones de RT-qPCR de Luna se pueden configurar y proteger de la luz durante un máximo de 8 horas a 25 °C y seguir manteniendo un rendimiento comparable al de las reacciones de control. Se observaron resultados similares al probar ensayos de 384 pocillos (volumen de reacción de 10 ul). Al preparar ensayos de 96 pocillos (volumen de reacción de 20 ul) con antelación con todo excepto la entrada de la muestra, hemos observado un rendimiento similar cuando la premezcla de reacción (paso 4 del protocolo/manual) se almacena durante más de 48 horas a 4 °C (protegida de la luz) en comparación con las reacciones de control realizadas inmediatamente después de configurar la reacción.