New England Biolabs, E3025L, Kit de mezcla maestra LunaScript® RT (sin imprimación)

El LunaScript RT Master Mix Kit (sin cebadores) presenta una mezcla maestra 5X optimizada que contiene todos los componentes necesarios para la síntesis de ADNc de primera cadena, excepto los cebadores. Categorías relacionadas Luna® qPCR y RT-qPCR,, RT-PCR,, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas Aplicaciones RT-PCR,, Síntesis de ADNc,, Transcripción inversa (síntesis de ADNc), Preguntas frecuentes P: ¿Puedo usar muestras de ARN purificadas de diferentes condiciones de almacenamiento como RNALater en mis reacciones de síntesis de ADNc LunaScript®? R: En general, las muestras de ARN purificadas de diferentes fuentes funcionan bien con los productos LunaScript. Normalmente recomendamos la purificación de ARN utilizando métodos basados ​​en columnas (p. ej., Monarch® RNA Miniprep Kit (NEB #T2010S)). P: ¿Puedo configurar mi reacción de síntesis de ADNc a temperatura ambiente cuando uso LunaScript® RT SuperMix? R: Sí. Las reacciones de síntesis de ADNc LunaScript se pueden configurar a temperatura ambiente. P: ¿Puedo usar los productos de ADNc de LunaScript® directamente en qPCR? ¿Cuánto puedo usar para la detección en una reacción de qPCR? R: El producto de ADNc se puede usar directamente en la reacción de qPCR. En general, recomendamos 1 μl de producto de ADNc en una detección de qPCR de 20 μl. Cuando sea útil, hasta el 20 % del volumen de qPCR puede ser producto de ADNc sin diluir (p. ej., 4 μl de producto de ADNc en una reacción de qPCR de 20 μl). P: ¿Cuánta plantilla de ARN debo usar en mis reacciones de síntesis de ADNc de LunaScript®? R: Las mezclas de LunaScript funcionan bien con plantillas de ARN purificadas, incluyendo ARN total, ARNm y muestras de transcripciones in vitro. Cantidad en la reacción de 20 μl ARN total ≤ 1 μg Poli(A)-ARN ≤ 1 μg Transcripciones in vitro 100 ng P: ¿Cómo debo almacenar los productos de ADNc de LunaScript®? A: El producto de ADNc se puede almacenar a 4 °C para uso a corto plazo. Para almacenamiento a largo plazo, debe almacenarse a -20 °C o -80 °C. P: ¿Cómo debo elegir entre un enfoque de RT-qPCR de un paso o RT-qPCR de dos pasos? R: Hay dos métodos disponibles para cuantificar muestras de ARN: RT-qPCR de un paso y de dos pasos. En ambos casos, el ARN primero se transcribe de forma inversa en ADNc, que luego se utiliza como plantilla para la amplificación por qPCR. La transcripción inversa se puede realizar por separado de la qPCR (es decir, RT-qPCR de dos pasos) o directamente en la mezcla de qPCR (es decir, RT-qPCR de un paso). Los flujos de trabajo de un paso se prefieren comúnmente en ensayos de diagnóstico molecular, donde las entradas de muestras pueden ser limitantes o se examinan numerosas muestras. Se prefiere la RT-qPCR de dos pasos cuando se realizarán múltiples interrogaciones del mismo material de partida o donde puede requerirse el archivo de ADNc. Para más detalles, consulte “Elección de RT-qPCR de un solo paso o RT-qPCR de dos pasos”. P: ¿Debo incluir una reacción de control sin transcriptasa inversa (RT) al configurar mi reacción de síntesis de ADNc? R: Sí. Cuando está presente, el ADN genómico o los productos de arrastre pueden interferir con la cuantificación precisa del ARN, especialmente en dianas con un bajo número de copias. Por lo tanto, es importante realizar las reacciones de control sin RT adecuadas para tener en cuenta estos efectos. Además, se deben configurar las reacciones de control sin plantilla (NTC) para demostrar que las reacciones positivas son significativas. Consulte el kit LunaScript RT SuperMix (NEB n.° E3010) si necesita una mezcla de control sin RT. P: ¿Qué reactivos de qPCR recomiendan para la detección de productos de ADNc? R: Los productos de ADNc generados con las mezclas LunaScript® se han evaluado exhaustivamente en qPCR utilizando la mezcla maestra Luna® Universal qPCR (NEB n.° M3003) y la mezcla maestra Luna Universal Probe qPCR (NEB n.° M3004). En combinación, estos productos proporcionan un flujo de trabajo de RT-qPCR de dos pasos con excelente sensibilidad y cuantificación lineal precisa. Además, LunaScript es compatible con otras de las principales mezclas comerciales para qPCR. P: ¿Por qué obtengo bajos rendimientos de ADNc? R: Existen varias causas para un bajo rendimiento de ADNc. A continuación, se ofrecen algunas sugerencias para mejorar el rendimiento: Compruebe la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante o con BioAnalyzer (Agilent). Un ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. El ARN debe tener una relación mínima A260/A280 de 1,7 o un número RIN superior a 8. La precipitación con etanol seguida de un lavado con etanol al 70 % puede eliminar contaminantes como el EDTA y el guanidinio. La precipitación con cloruro de litio puede eliminar polisacáridos. Un paso de purificación de ARN mediante kits de extracción de ARN o extracción con fenol/cloroformo puede eliminar proteínas contaminantes como las proteasas. Aumente la cantidad de ARN utilizada, especialmente para ARN poco abundante. P: ¿El colorante azul del LunaScript® RT SuperMix interferirá con la detección? R: Los productos LunaScript contienen un colorante de referencia visual inerte que le da a la mezcla un color azul claro. Esta apariencia coloreada facilita el seguimiento de la configuración de la reacción al identificar la presencia frente a la ausencia y las diferencias de volumen de las reacciones de ADNc dentro de los tubos, las puntas de pipeta y las reacciones de qPCR posteriores. El colorante azul se ha evaluado ampliamente en la síntesis de ADNc y en experimentos de qPCR y no se ha observado que inhiba ni interfiera con la detección de ARN. P: ¿Cómo elijo entre los kits de síntesis de ADNc de primera cadena de NEB? R: La Tabla 1 destaca las principales ventajas y aplicaciones de los kits de síntesis de ADNc de primera cadena de NEB. Kits de síntesis de ADNc Kit LunaScript® RT SuperMix (NEB n.° E3010) Kit LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) (NEB n.° E3025) Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript® II (NEB n.° E6560) Componentes LunaScript RT SuperMix (5X)* Mezcla de control sin RT (5X)* Agua sin nucleasas *Ambas mezclas contienen hexámero y d(T)10 LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) (5X) Mezcla de control sin RT (sin cebadores) (5X) Agua sin nucleasas Mezcla enzimática ProtoScript II (10X) Mezcla de reacción ProtoScript II (2X) Oligo d(T)23VN (50 µM) Mezcla de cebadores aleatorios (60 µM) Agua sin nucleasas Formato Aplicación recomendada Cebadores Incubación Para detección RT-qPCR de 2 pasos Hexámero y d(T)10 incluidos 25 °C 2 min; 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Para detección por RT-qPCR de 2 pasos Mezcla de cebadores aleatorios 25 °C 2 min; 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Para síntesis general de ADNc d(T)23VN o cebadores específicos del gen 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Mezcla de cebadores aleatorios 25 °C 2 min; 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Para síntesis general de ADNc d(T)23VN o cebadores específicos del gen 42 °C 60 min; 80 °C 5 min Mezcla de cebadores aleatorios 25 °C 5 min; 42 °C 60 min; 80 °C 5 min Ventajas ✓ Supermix ✓ Protocolo corto ✓ Un indicador de seguimiento visible ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Mayor volumen de entrada de ARN ✓ Elección flexible de cebadores ✓ Protocolo corto ✓ Un indicador de seguimiento visible ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Mayor volumen de entrada de ARN ✓ Elección flexible de cebadores ✓ Todo incluido Siga el árbol de decisiones a continuación para elegir el kit de síntesis de ADNc de primera cadena en función de sus aplicaciones posteriores. Figura 1. LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) admite numerosas aplicaciones. Al agregar diferentes cebadores, incluidos Random Primer Mix, d(T)23VN y hexámeros aleatorios, el ADNc producido por LunaScript RT Master Mix puede ser ideal para aplicaciones posteriores como la detección por RT-qPCR, RT-PCR y estudios de ARN-seq. P: Al utilizar productos de ADNc de LunaScript en la PCR posterior (es decir, RT-PCR de dos pasos), ¿qué volúmenes y productos de PCR se pueden utilizar? R: Los productos de ADNc de las reacciones de LunaScript son compatibles con muchos reactivos de PCR. Normalmente, recomendamos la mezcla maestra OneTaq 2X (NEB n.° M0482 o NEB n.° M0485) para la detección por PCR de hasta 5 kb, la mezcla maestra Q5 Hot Start High-Fidelity 2X (NEB n.° M0494) para la máxima fidelidad y la mezcla maestra LongAmp Taq 2X (NEB n.° M0287) para obtener altos rendimientos a partir de productos más largos. Dependiendo de los objetivos/cebadores, la entrada óptima de ADNc puede variar y debe optimizarse, pero normalmente recomendamos 1 μl de la reacción de ADNc como entrada en una PCR de 25 μl. Cuando sea útil, se puede añadir hasta un 20 % del volumen de PCR (p. ej., 5 μl de producto de ADNc en una PCR de 25 μl). P: ¿Cómo elijo cebadores para la síntesis de ADNc utilizando LunaScript RT Master Mix (sin cebador)? R: El cebador óptimo para la síntesis de ADNc depende de la aplicación posterior deseada. Aplicaciones posteriores Cebadores Objetivo Cuantificación de qPCR Mezcla de cebadores aleatorios (NEB n.º S1330S) Recomendación típica: 6 µM final Cobertura uniforme Síntesis general de ADNc Oligo d(T)23VN (NEB n.º S1327S) Recomendación típica: 5 µM final Síntesis de ADNc de longitud completa Mezcla de cebadores aleatorios o cebador aleatorio Recomendación típica: 6 µM final Cobertura uniforme Cebador específico del gen Recomendación típica: 0,5 µM final (rango: 0,1 - 1 µM) ADNc específico del objetivo P: ¿Puedo utilizar LunaScript RT Master Mix en flujos de trabajo de secuenciación de ARN? R: LunaScript RT Master Mix es compatible con diferentes cebadores, incluidos los cebadores aleatorios y los cebadores oligo-dT. Para la mayoría de los flujos de trabajo de secuenciación de ARN, la mezcla maestra LunaScript RT puede incorporarse como paso de síntesis de ADNc. P: ¿Qué temperatura debo usar para mi reacción de síntesis de ADNc con LunaScript®? R: La transcriptasa inversa termoestable Luna® facilita una síntesis eficiente de ADNc a temperaturas elevadas en comparación con la RT MMLV. Para la mayoría de los objetivos, la síntesis de ADNc puede lograrse con una incubación de 10 minutos a 55 °C. Para moldes difíciles, la temperatura de síntesis de ADNc puede aumentarse hasta 65 °C. P: ¿Cómo elijo entre la transcriptasa inversa Induro y los diferentes productos LunaScript y ProtoScript? R: La transcriptasa inversa Induro es una RT codificada por intrones del grupo II, útil para la síntesis de ADNc a partir de transcripciones largas, ARN con estructuras secundarias fuertes y muestras de ARN con inhibidores. Por el contrario, los reactivos LunaScript son mezclas maestras. El kit LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) (NEB n.° E3025) es adecuado para la síntesis general de ADNc. Los productos LunaScript RT SuperMix (NEB n.° E3010/M3010) están optimizados para flujos de trabajo de RT-qPCR de dos pasos donde solo se requieren productos cortos de ADNc. LunaScript RT SuperMix también se incluye en el flujo de trabajo de secuenciación ARTIC SARS-CoV-2. Esta tabla describe las aplicaciones y características de cada uno. Productos de RT retrovirales con codificación intrónica Induro™ Transcriptasa inversa (NEB n.° M0681) Kit LunaScript® RT SuperMix (NEB n.° E3010) LunaScript RT SuperMix (NEB n.° M3010) Kit LunaScript RT Master Mix (NEB n.° E3025) Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript® II (NEB n.° E6560) Aplicaciones Síntesis de ADNc larga Muestras de ARN impuro Aplicaciones de ARN-seq (p. ej., secuenciación directa de ARN, secuenciación de ADNc de lectura larga, secuenciación de ARNt Aplicaciones Detección por RT-qPCR en 2 pasos Flujo de trabajo de ARN-seq Aplicaciones Flujo de trabajo de ARN-seq Detección por RT-qPCR en 2 pasos Síntesis general de ADNc Detección por RT-PCR en 2 pasos Aplicaciones Síntesis general de ADNc Flujo de trabajo de ARN-seq Detección por RT-PCR en 2 pasos ✓ Protocolo corto ✓ Elección flexible de cebadores, dNTP modificados ✓ Mayor temperatura de reacción ✓ Supermix ✓ Protocolo corto ✓ Colorante de seguimiento ✓ Mayor temperatura de reacción ✓ Selección flexible de cebadores ✓ Protocolo corto ✓ Colorante de seguimiento ✓ Mayor temperatura de reacción ✓ Selección flexible de cebadores ✓ El formato del kit incluye todos los componentes necesarios. P: ¿Cómo sé si mi ARN molde es de buena calidad? R: El ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. Una relación de absorbancia A260/A280 superior a 1,7 o un número RIN superior a 8 en un BioAnalyzer suele indicar ARN de alta calidad.