Kit de RT-qPCR de un solo paso Luna® Cell Ready, E3030S, New England Biolabs

Vaya directamente de las células a la cuantificación de ARN sin purificación Categorías relacionadas Luna® qPCR y RT-qPCR, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación Aplicaciones qPCR y RT-qPCR, RT-qPCR de dos pasos, Amplificación de ADN, PCR y qPCR Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Solución salina tamponada con fosfato (PBS) Cebadores específicos de la diana Células Tubos Eppendorf, tubos de tiras para PCR Placas de PCR Instrumento qPCR Pipetas y puntas de pipeta (para minimizar la contaminación cruzada, se deben usar puntas con filtro) Preguntas frecuentes P: ¿Qué líneas celulares son compatibles con el kit Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR (NEB n.º E3030)? R: Se pueden usar numerosas líneas celulares para la detección directa de ARN utilizando el kit Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR. Sin embargo, algunas líneas celulares pueden contener altos niveles de inhibidores que pueden afectar la lisis celular o la reacción de RT-qPCR. El medio de cultivo y el tratamiento con fármacos/ARNi/CRISPR también pueden afectar el estado de crecimiento celular y los niveles de inhibidores. La siguiente tabla destaca los resultados observados con varias líneas celulares de mamíferos utilizando una serie de dilución de 5 logaritmos (100.000 -10 células por 50 µl de lisis) y la posterior detección de 1 µl de lisado en un experimento de RT-qPCR de un solo paso de 20 µl. Para cada línea celular, los resultados lineales se indican en la última columna de la tabla a continuación. Además de estas líneas celulares de mamíferos, el kit también es compatible con líneas celulares de insectos. Para las líneas celulares que no se enumeran a continuación, se recomienda realizar una prueba piloto para determinar el número óptimo de células de entrada para la lisis, así como la cantidad de lisado que se puede transportar a la RT-qPCR. Líneas celulares Propiedad Especie Número de células por 50 µl de lisado HeLa Hs. Adherente Cervix, adenocarcinoma 10 - 100.000 A549 Hs. Adherente. Pulmón, carcinoma 10 - 100.000 Jurkat Suspensión Hs. Linfocito T, leucemia 10 - 100.000 HEK293 Adherente Hs. Riñón 10 - 100.000 U2Os Adherente Hs. Hueso, osteosarcoma 10 - 100.000 HepG2 Adherente Hs. Hígado, carcinoma 10 - 1.000 K-562 Suspensión Hs. Linfoblasto, leucemia 10 - 100.000 NCI-H460 Adherente Hs. Pulmón, carcinoma 10 - 100.000 SK-N-SH Adherente Hs. Cerebro, neuroblastoma 10 - 10.000 P: ¿Cuántas células debo usar para una detección confiable? R: El módulo de lisis Luna Cell Ready tiene una capacidad de lisis de 10 a 100 000 células en una reacción de lisis de 50 µl. Normalmente, se pueden transferir de 1 a 2 µl de lisado celular (equivalente al ARN de 0,2 a 4000 células) a una reacción RT-qPCR de 20 µl. La mayoría de los transcritos se pueden detectar en una muestra de 20 a 200 células en una reacción típica de 20 µl. Sin embargo, algunas líneas celulares pueden contener altos niveles de inhibidores de la lisis celular o de las reacciones RT-qPCR. Para una comprobación rápida de la expresión génica, un buen punto de partida para la optimización es aproximadamente 1000 células por reacción de 50 µl. Consulte las preguntas frecuentes adicionales para obtener orientación sobre líneas celulares específicas. Las muestras valiosas con pocas células (≤10) también se pueden lisar con el módulo de lisis Luna Cell Ready y su posterior detección mediante el kit Luna Universal Probe RT-qPCR. Sin embargo, se requiere la modificación de la mezcla de lisis celular como se indica a continuación. Se recomiendan experimentos piloto para optimizar todo el flujo de trabajo antes de usar muestras valiosas/limitadas. Componentes Volumen total (25 µL) Tampón de lisis Luna Cell Ready (2X) 12,5 µL DNasa I (libre de RNasa) (10X) 2,5 µL Reactivo de protección de ARN Luna Cell Ready 2,5 µL Proteasa Luna Cell Ready 0,25 µL Solución de parada Luna Cell Ready 2,5 µL Células Variable, hasta 2,5 µL Agua libre de RNasa Hasta un volumen final de 25 µL P: ¿Cuántas células debo sembrar en placas de cultivo celular para lograr una detección óptima? R: Siguiendo las pautas generales de cultivo celular, no sembrar células para superar los rendimientos promedio por pocillo al 100% de confluencia (consulte las pautas de los fabricantes, la tabla a continuación se modificó de Corning Inc. como ejemplo). Tenga en cuenta que las células podrían seguir dividiéndose después de la siembra. Asegúrese de que el número de células en la cosecha esté dentro de la capacidad de lisis. Además, una prueba inicial puede ayudar a determinar el rango óptimo de entradas de células para sus líneas celulares o amplicones específicos. Placas de cultivo celular Rendimiento promedio (100% de confluencia) 6 pocillos 9,5 x 10⁻¹ 12 pocillos 3,8 x 10⁻¹ 24 pocillos 1,9 x 10⁻¹ 48 pocillos 0,95 x 10⁻¹ 96 pocillos 3,2 x 10⁻¹ 384 pocillos 5,6 x 10⁻¹ P: ¿Se pueden usar líneas celulares criopreservadas o células sedimentadas almacenadas a -80 °C con este kit? R: Sí, el módulo de lisis Luna Cell Ready es compatible con células criopreservadas siempre que se haya mantenido la viabilidad celular. Si se van a utilizar habitualmente pellets celulares congelados, se debe alícuota la cantidad deseada de células antes de la sedimentación y la congelación, si es posible. P: ¿Cómo se puede determinar la eficiencia de la lisis? R: Para determinar la eficiencia de la lisis, se debe evaluar la RT-qPCR en una dilución de células de 5 logaritmos. Resuspenda las células en la solución de resuspensión celular y realice la lisis de 10 a 100 000 células por cada 50 µl de reacción. Realice una RT-qPCR de un solo paso con los lisados ​​celulares y compruebe la eficiencia de la RT-qPCR utilizando un gen de interés (la diana/los cebadores deben validarse primero utilizando ARN puro). La eficiencia ideal debería ser del 90 % al 110 %. Una eficiencia <90 % suele indicar daño del ARN. Una eficiencia >110 % con Cq inicial retardada puede implicar la presencia de posibles inhibidores en la RT-qPCR. P: ¿Por qué es importante evaluar el daño o la inhibición del ARN durante la lisis celular y la detección mediante RT-qPCR de un solo paso? R: En altas concentraciones, ciertos componentes celulares pueden dañar el ARN o inhibir la lisis celular y los pasos de RT-qPCR, lo que resulta en una cuantificación inexacta de la expresión del ARN. En presencia del reactivo de protección de ARN Luna Cell Ready, el daño al ARN puede reducirse drásticamente. Se pueden utilizar dos enfoques para evaluar el rendimiento adecuado del flujo de trabajo Luna Cell Ready. 1) Incorpore un ARN de referencia al preparar la mezcla para la lisis celular. (Compare los valores de Cq de su ARN de referencia en presencia o ausencia de células. Valores de Cq similares (diferencia de Cq ≤1) indican un daño limitado al ARN y una inhibición mínima de las reacciones de RT-qPCR. Se recomienda utilizar un ARN de referencia sin homología con la población de ARN. Por ejemplo, si trabaja con líneas celulares humanas, el ARN del fago Lambda transcrito in vitro puede ser una opción). 2) Realice una RT-qPCR de un solo paso con ARN total purificado aproximadamente equivalente a la cantidad de ARN en el lisado celular. Por ejemplo, cuando se cosechan las células, la mitad de la cantidad se puede usar para la extracción de ARN utilizando un kit basado en columna (p. ej., Monarch Total RNA Miniprep Kit, NEB#T2010S) mientras que la otra mitad se puede preparar con el módulo de lisis Luna Cell Ready. Valores similares de Cq sugieren una lisis celular eficiente. De lo contrario, disminuya el número de células hasta que se obtengan resultados similares. P: ¿Qué es el "Luna Cell Ready RNA Protection Reagent" y cuándo se debe utilizar? R: Durante la lisis celular, se liberan nucleasas endógenas que pueden degradar de forma inespecífica el ARN celular. El Luna Cell Ready RNA Protection Reagent ha sido optimizado para limitar la degradación del ARN durante el procedimiento de lisis celular. Recomendamos incluir el Luna Cell Ready RNA Protection Reagent en la resuspensión, dilución y lisis celular (como se especifica en el manual) para minimizar el daño al ARN. P: ¿Debo incluir una reacción de control No-RT? R: Las reacciones de control sin RT son útiles para determinar los problemas que pueden surgir de la amplificación del ADNg presente en una muestra. En general, el kit Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR ofrece una eliminación eficiente del ADN genómico (>95%). Por ejemplo, con un transcrito abundante como la β-actina, el ADN genómico se detecta aproximadamente 10 ciclos más tarde que con la detección del ARN tras la eliminación del ADN. Sin embargo, muchos transcritos de ARN presentan una baja abundancia. Para estos transcritos, se recomienda realizar una reacción de control sin RT, especialmente si los conjuntos de cebadores no abarcan las uniones exón-exón. Además, no se deben incluir reacciones de control de plantilla (NTC) para demostrar que las reacciones positivas son significativas. P: ¿El colorante de seguimiento azul interferirá con la detección? R: El tampón de lisis Luna Cell Ready contiene un colorante de referencia visual inerte. Este colorante facilita la monitorización de la configuración de la reacción y garantiza una transferencia de líquido adecuada entre las placas de lisis y RT-qPCR. El colorante azul se ha evaluado ampliamente en los experimentos de reacción de lisis celular y RT-qPCR. No se ha observado ninguna inhibición ni interferencia. P: ¿Es necesario lavar las células antes de la lisis? R: Para obtener los mejores resultados, recomendamos lavar las células para eliminar el medio no deseado y las células muertas. Sin embargo, en situaciones donde esto no sea práctico, como en el cribado de alto rendimiento o en estudios de expresión génica extremadamente sensibles donde los lavados celulares pueden cambiar la abundancia de ARN, se puede usar el volteo de la placa para una eliminación efectiva del medio. Si se omite el paso de lavado, los lisados ​​deben usarse inmediatamente, sin ciclos de congelación y descongelación. P: ¿Qué formato de lisis debo usar? R: Para células adherentes que crecen en placas, la lisis se puede realizar en la placa para simplificar el flujo de trabajo y reducir la pérdida de células. Para células no adherentes, suspenda las células en solución de resuspensión celular y lise un volumen apropiado (consulte el protocolo para obtener más detalles). P: ¿Qué protocolo se debe usar para la lisis celular? ¿Se pueden lisar las células a temperatura ambiente o usando un protocolo corto? R: Para obtener los mejores resultados, recomendamos usar un protocolo de lisis estándar de 10 min a 37 °C seguido de una inactivación de 5 min a 25 °C. Sin embargo, se han probado temperaturas de lisis de 25-37 °C con el módulo de lisis Luna Cell Ready. Si el número de células es inferior a 10 000 (por 50 µl de reacción de lisis), también se pueden usar 10 min a 25 °C. Aunque el período recomendado es de 10 min a 37 °C para la lisis celular, también se han probado incubaciones de 5 a 20 min. La incubación a 37 °C durante 5 min es aceptable para la liberación de ARN si la eliminación de ADN genómico NO es una prioridad alta. Tenga en cuenta que el paso de inactivación posterior (5 min) no debe reducirse. Use el lisado inmediatamente o guárdelo en hielo y úselo en un plazo de 5 horas. P: Al usar lisados ​​celulares generados por el módulo de lisis Luna Cell Ready, ¿se pueden realizar experimentos de RT-qPCR a temperatura ambiente? R: Sí, la RT-qPCR puede prepararse a temperatura ambiente. Sin embargo, los lisados ​​celulares son sensibles a la temperatura; si es posible, manténgalos en hielo durante la preparación de la reacción. Una vez preparada la placa de RT-qPCR, realice las reacciones lo antes posible. Si se requiere un almacenamiento breve de la placa de RT-qPCR, manténgala a 4 °C durante un máximo de 5 horas para la detección con colorante. Para la detección con sonda, el experimento de RT-qPCR debe comenzar inmediatamente después de la preparación. Para un cribado de alto rendimiento mediante automatización, minimice el tiempo que los lisados ​​permanecen a temperatura ambiente (no más de 15 minutos antes de iniciar el proceso) y evite los ciclos de congelación y descongelación. P: ¿Cuánto lisado celular debo usar como entrada con Luna Cell Ready One-Step RT-PCR? R: La cantidad de lisado celular que se puede agregar a la RT-qPCR de un solo paso dependerá del kit de RT-qPCR. Al usar el kit Luna Universal One-Step RT-qPCR, el lisado puede representar fácilmente hasta el 10 % del volumen total de la reacción y ≤ 4000 células por experimento de RT-qPCR de 20 μl. P: ¿Puedo usar los lisados ​​celulares generados con el módulo de lisis Luna Cell Ready para RT-qPCR de dos pasos? R: Para obtener los mejores resultados, recomendamos usar los lisados ​​en RT-qPCR de un paso. Si se planea usar lisados ​​celulares para RT-qPCR de dos pasos, se recomiendan experimentos piloto para optimizar la cantidad de lisado celular. Aproximadamente 200 células por reacción de RT de 20 μl es un buen punto de partida para la optimización. P: ¿Por qué el kit Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR contiene más reacciones de RT-qPCR que de lisis? R: El kit Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR combina un módulo de lisis con 100 reacciones de lisis y un módulo One-Step RT-qPCR de 500 reacciones. Esta combinación se basa en una configuración experimental típica en la que el usuario puede ejecutar múltiples réplicas de un transcrito de interés (más una referencia) con los controles adecuados sin RT. De forma conservadora, una reacción de lisis celular de 50 µl es suficiente para al menos 40 reacciones de RT-qPCR, suponiendo 1 µl de lisado por reacción. Aumente la escala de reacciones de lisis según corresponda si se planean más reacciones de RT-qPCR. Tanto el módulo de lisis Luna Cell Ready (NEB n.° E3032) como el kit Luna Universal One-Step RT-qPCR (NEB n.° E3005) pueden solicitarse por separado si es necesario. P: Si se agotan las existencias del módulo de lisis Luna Cell Ready o del kit Luna Universal One-Step RT-qPCR, ¿puedo solicitarlos por separado? R: Sí. Ambos módulos pueden solicitarse por separado. El módulo de lisis Luna Cell Ready (NEB n.° E3032) está disponible en 100 reacciones de lisis (50 µl). El kit Luna Universal One-Step RT-qPCR (NEB n.° E3005) está disponible en cuatro tamaños (20 µl por reacción): E3005S (200 reacciones), E3005L (reacciones), E3005X (1000 reacciones) y E3005E (2500 reacciones). El rendimiento general de la RT-qPCR directa de células en un solo paso depende tanto del módulo de lisis como del kit One-Step RT-qPCR. Para obtener los mejores resultados, se recomienda combinar ambos módulos. P: ¿Cómo puedo obtener más ayuda técnica sobre el kit Luna Universal One-Step RT-qPCR? R: Consulte las preguntas frecuentes y el manual en www.neb.com/E3005 o www.neb.com/E3006.