New England Biolabs, E3313S, Kit de ribosoma PURExpress® Δ

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R: Haga clic para ver el conjunto completo de preguntas frecuentes de PURExpress. P: ¿En qué se diferencia el kit Δ Ribosome E3313S del kit PURExpress E6800S? R: El kit PURExpress Δ Ribosome fue diseñado para satisfacer las necesidades de los laboratorios que estudian la traducción que utilizan sus propios ribosomas. En el kit PURExpress Δ Ribosome, los ribosomas de control suministrados son suficientes para dos reacciones. Los demás componentes del kit son suficientes para 10 reacciones. Recomendamos encarecidamente que, al utilizar sus propios ribosomas, titule la cantidad necesaria para una traducción óptima de la proteína en la reacción PURExpress. Para obtener información detallada de uso, consulte el manual del producto. P: Al utilizar PURExpress, pude sintetizar la proteína diana, pero el producto de longitud completa no es una especie principal. R: La iniciación o terminación de la traducción no es correcta. La producción de la proteína de longitud completa requiere una iniciación y terminación adecuadas. Los sitios de entrada internos al ribosoma o la terminación prematura pueden producir proteínas truncadas no deseadas. La iniciación en codones AUG no auténticos y la terminación prematura son difíciles de controlar. Si hay muchos codones raros o el objetivo tiene un porcentaje inusualmente alto de un aminoácido en particular, la suplementación del ARNt "faltante" puede ayudar. P: Al usar PURExpress, ¿no pude sintetizar la proteína de control? R: Los componentes del kit están inactivados Se requiere el almacenamiento de todos los materiales a -80 °C y se debe minimizar el número de ciclos de congelación y descongelación. Contaminación por nucleasas Para evitar la contaminación por nucleasas, use guantes y use puntas y tubos libres de nucleasas. También recomendamos agregar inhibidor de ARNasa (por ejemplo, NEB #M0314) a las reacciones. P: Al usar PURExpress, ¿pude sintetizar la proteína de control, pero la muestra objetivo no está presente o está presente en un bajo rendimiento? R: Contaminación por ARNasa Los minikits de preparación comerciales son una herramienta útil para la preparación de ADN molde, pero a menudo son la fuente de introducción de ARNasa A en la reacción de síntesis de proteínas in vitro. La inclusión del inhibidor de la ARNasa (NEB n.º M0314S, 20 unidades/reacción de 25 μl) a menudo supera este problema. El diseño del ADN molde está comprometido Asegúrese de que la secuencia del ADN molde sea correcta. La región codificante, así como las secuencias reguladoras, deben ser correctas y estar en marco para garantizar que la traducción se inicie correctamente y que se genere un producto de longitud completa. Las secuencias reguladoras no óptimas o el espaciamiento pueden afectar negativamente la eficiencia de la traducción. La iniciación de la traducción es un paso clave para una síntesis proteica exitosa. La estructura secundaria o los codones raros al comienzo del ARNm pueden comprometer el proceso de iniciación y afectar negativamente la síntesis proteica. La adición de una buena región de iniciación (p. ej., los primeros diez codones de la proteína de unión a maltosa) puede ayudar, suponiendo que se pueda tolerar la adición de residuos a la secuencia diana. Alternativamente, usar PCR para modificar el extremo 5' del gen diana puede ser una estrategia exitosa para eliminar elementos estructurales secundarios o codones raros. El ADN molde está contaminado Puede haber inhibidores de la transcripción o la traducción en el ADN. Un simple experimento de mezcla (ADN de control + ADN diana, comparado con ADN de control solo) revelará si hay inhibidores presentes. Los inhibidores en el ADN diana reducirán el rendimiento de la proteína de control. No utilice ADN purificado a partir de geles de agarosa, ya que a menudo contienen inhibidores de la traducción (p. ej., bromuro de etidio). El SDS residual de los protocolos de preparación de plásmidos es otro contaminante común y puede eliminarse mediante extracción con fenol:cloroformo y precipitación con etanol. Al realizar la precipitación con etanol, recomendamos el uso de acetato de sodio en lugar de acetato de amonio, un inhibidor conocido de la traducción. Tenga cuidado de eliminar todos los rastros de etanol. Las plantillas producidas por PCR deben estar libres de productos de amplificación no específicos. Estos contaminantes pueden contener señales de transcripción y, por lo tanto, competir por los componentes de transcripción y/o traducción y titularlos. Como resultado, los rendimientos pueden verse afectados y pueden producirse productos truncados no deseados. La concentración de ADN plantilla no es óptima La concentración de ADN plantilla es importante ya que la síntesis de proteínas in vitro es un equilibrio entre la transcripción y la traducción. Muy poca plantilla reduce la cantidad de ARNm traducido activamente, mientras que demasiada plantilla da como resultado la sobreproducción de ARNm y la sobrecarga del aparato traduccional. Recomendamos 250 ng de ADN plantilla para una reacción de 25 μl. La optimización con diferentes cantidades de ADN plantilla (por ejemplo, 25-1000 ng) puede mejorar el rendimiento de una proteína diana particular. Si se utilizó la absorbancia UV para calcular la concentración de ADN plantilla, tenga en cuenta que el ARN o el ADN cromosómico también absorberán la luz UV. Si su muestra tiene cantidades significativas de ARN o ADN cromosómico, la cantidad real de ADN plantilla puede ser menor que la cantidad calculada. La relación 260 nm/280 nm debe ser 1,8. El procesamiento de una parte del ADN plantilla en un gel de agarosa puede revelar la presencia de otros ácidos nucleicos, así como cualquier degradación o tamaño incorrecto del ADN plantilla. P: ¿Dónde puedo encontrar todas las preguntas frecuentes de IMPACT? R: Preguntas frecuentes de IMPACT P: ¿Hay citas de PURExpress? R: Sí. Las citas de PURExpress se pueden encontrar aquí.