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BRAND / VENDOR: New England Biolabs

New England Biolabs, E3321S, Kit de detección de mutaciones EnGen®

CATALOG NUMBER: E3321S
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Product Description
Categorías relacionadas Validación de la edición genética basada en CRISPR, Enzimas reparadoras de ADN y endonucleasas específicas de la estructura Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Cebadores de oligodesoxirribonucleótidos para PCR Tubos o tiras de reacción de PCR Agua libre de nucleasas Termociclador Puntas de aerosol para PCR Preguntas frecuentes P: ¿Por qué veo una banda adicional cuando corro el heterodúplex sin digerir en un gel de agarosa? R: En algunos casos, el ADN heterodúplex sin digerir se ejecutará ligeramente más lento que el ADN homodúplex. Dependiendo de la composición de las mutaciones, esto a veces se puede ver como una banda que corre por encima del homodúplex en un gel de agarosa. P: ¿Por qué veo muy poco ADN en mi gel o baja señal en el analizador de fragmentos? R: Verifique que el rendimiento de la reacción de PCR fue suficiente antes de continuar con la digestión y el análisis. Realice la reacción de control para asegurarse de que el kit esté funcionando correctamente. P: ¿Reconocerá la EnGen® T7 Endonuclease I los desajustes de una sola base y las inserciones o deleciones de una sola base (indels)? R: La Endonuclease T7 no reconoce eficazmente los indels ni los desajustes de menos de dos bases. P: ¿Se pueden utilizar lisados ​​celulares en la reacción de PCR? R: Hemos probado con éxito el extracto crudo preparado con QuickExtract™ (Epicentre n.° QE09050) y DNAzol® Direct (Molecular Research Center, INC n.° DN 131). No recomendamos el uso de otros reactivos. Se incluyen reactivos de PCR adicionales para optimizar la amplificación. P: ¿Cuáles son los resultados esperados utilizando el control incluido? R: La mezcla de plantilla de control y cebador incluida contiene dos plásmidos que, al amplificarse, producirán amplicones con y sin una inserción de 10 pb. Los cebadores incluidos en esta mezcla amplificarán una región de ~600 pb alrededor de esta inserción. Tras la desnaturalización y la reasociación de estos productos de PCR, algunos formarán heterodúplex. La endonucleasa I T7 detectará los heterodúplex y los cortará para producir fragmentos de ~200 pb y ~400 pb. Los fragmentos se pueden detectar mediante electroforesis en gel de agarosa estándar o utilizando analizadores de fragmentos. P: El rendimiento de mi reacción de PCR es bajo, ¿puedo agregar más de 5 µl de la reacción de PCR a la reacción de digestión? R: La digestión ha sido optimizada para su uso con hasta 5 µl de reacción de PCR sin purificar. Agregar más de 5 µl de la reacción de PCR podría interferir con la reacción de digestión. Recomendamos optimizar la reacción de PCR para obtener un mayor rendimiento o concentrar la reacción de PCR mediante purificación en columna utilizando el kit NEB Monarch PCR & DNA Cleanup (5 μg) (NEB #T1030). P: ¿Hay un precipitado en el fondo del tubo de Master Mix? ¿Es esto normal? R: Q5® Master Mix puede precipitar al congelar y descongelar. Esto no indica un problema con el producto. Para un rendimiento óptimo, descongele completamente y resuspenda cualquier precipitado calentándolo a temperatura ambiente e invirtiéndolo suavemente hasta que se disuelva por completo.

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Tony Tang

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