New England Biolabs, E3330L, Kit de preparación de biblioteca de ARN NEBNext UltraExpress®

El kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress es la última generación de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext y ofrece un flujo de trabajo rápido y optimizado. Con un protocolo de preparación de bibliotecas de 3 horas, el kit permite la creación de bibliotecas direccionales de ARN de alta calidad en un solo día, junto con kits de enriquecimiento de ARNm o de depleción de ARNr. Categorías relacionadas : Preparación de bibliotecas para Illumina, Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina, Especificaciones de preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación . Materiales necesarios pero no suministrados. Oligonucleótidos multiplex NEBNext para Illumina®. Las opciones de oligonucleótidos multiplex NEBNext se pueden encontrar en www.neb.com/oligos. Alternativamente, se pueden utilizar el adaptador y los cebadores proporcionados por el cliente. Consulte la información en el enlace: https://www.neb.com/faqs/2019/03/08/can-i-use-this-nebnext-kit-with-adaptors-and-primers-from-other-vendors-than-neb Kit de reactivos SPRIselect™ (Beckman Coulter®, Inc. n.º B23317) o perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63881) Gradilla magnética (NEB S1515S, Alpaqua® cat. n.º A001322 o equivalente) Etanol al 80 % (recién preparado) Termociclador Tubos de PCR en tiras libres de DNasa y ARNasa, por ejemplo, tiras flexibles de 8 tubos TempAssure® PCR (USA Scientific® n.º 1402-4708) Bioanalyzer® o TapeStation® (Agilent® Technologies, Inc.) y reactivos y consumibles asociados Para usar con Módulo de aislamiento magnético de ARNm NEBNext Poly(A) (NEB n.º E7490): tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y soporte magnético NEB n.º S1506 o equivalente (solo para lavar microesferas). Para usar con el kit de depleción de ARNr NEBNext v2 (humano/ratón/rata) (NEB n.º E7400) y otros kits de depleción de ARN NEBNext que no incluyen microesferas (NEB n.º E7750, E7850, E7865): microesferas Agencourt® RNAClean® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63987). Preguntas frecuentes P: ¿El kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress® es un kit de bibliotecas direccionales (de cadena)? R: Sí, el kit de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress tiene un flujo de trabajo de bibliotecas de ARN direccionales (de cadena). P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress® y el kit de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext® Ultra™ II? ¿Cómo elijo el adecuado? R: El kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress se ha optimizado para un procesamiento optimizado de la preparación de bibliotecas, con una concentración de adaptador y una condición de ciclado de PCR para todas las muestras dentro de las cantidades iniciales de 25-250 ng de ARN total. El kit de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra II ofrece condiciones más personalizadas según la cantidad de entrada, más pasos y limpiezas, un flujo de trabajo más largo y una recomendación de rango de entrada más amplia (10 ng – 1 µg de ARN total). Ambos kits producen altos rendimientos de bibliotecas de alta calidad, pero recomendamos elegir NEBNext UltraExpress RNA para todas sus muestras estándar dentro del rango de cantidad de entrada indicado, donde la velocidad es primordial. Recomendamos elegir NEBNext Ultra II Directional RNA para muestras más complejas y valiosas. P: ¿Es posible utilizar cantidades totales de ARN fuera del rango recomendado para el kit de biblioteca de ARN NEBNext UltraExpress®? R: Sí. Sin embargo, esto podría resultar en dímeros de adaptador más altos o menores rendimientos. La optimización de las diluciones de adaptador y los ciclos de PCR debe ser realizada experimentalmente por el usuario y se verá afectada por la calidad de la muestra. Sugerimos utilizar el kit de preparación de biblioteca de ARN direccional NEBNext® Ultra™ II para Illumina® (NEB n.° E7760/E7765) para cantidades totales de ARN fuera de los rangos recomendados para el kit de preparación de biblioteca de ARN NEBNext UltraExpress. P: ¿El kit de preparación de biblioteca de ARN NEBNext UltraExpress® incluye reactivos de aislamiento de ARNm poli(A) o de depleción de ARNr? R: No. Para el aislamiento de ARNm poli(A), recomendamos el módulo de aislamiento magnético de ARNm poli(A) NEBNext® (NEB n.° E7490). Para la depleción de ARNr, recomendamos cualquiera de nuestros kits de depleción de ARN (p. ej., NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human/Mouse/Rat)) (NEB n.° E7400/E7405). P: ¿Los kits de preparación de bibliotecas NEBNext UltraExpress® incluyen microesferas? R: No, recomendamos usar el kit de reactivos SPRIselect® (Beckman Coulter, Inc. n.° B23317) o las microesferas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.° A63881). P: ¿Puedo aislar el ARNm de poli(A) o deplecionar el ARNr y luego congelar mis muestras a -80 °C antes de comenzar la preparación de la biblioteca con el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress®? R: Sí, sin embargo, se requerirán algunas modificaciones. Si planea congelar su ARNm o ARNr deplecionado antes de la preparación de la biblioteca, se recomienda la elución de sus muestras en 4 µl de Tris [10 mM Tris HCl (pH 7,5), incluido con el módulo de aislamiento magnético de ARNm NEBNext® Poly(A) E7490] o agua libre de nucleasas. 2,5 µl de este eluido se transferirán entonces a un tubo nuevo y se combinarán con un volumen equivalente (2,5 µl) de NEBNext UltraExpress RNA Fragmentation Mix, para un volumen total de 5 µl. Se espera una pérdida de muestra ligeramente mayor utilizando este método en comparación con el protocolo estándar. Sin embargo, las recomendaciones de entrada y ciclado del adaptador seguirán siendo las mismas. La muestra de 5 µl se fragmentará entonces en solución. P: ¿Qué debo hacer si veo dímero de adaptador en mis bibliotecas NEBNext UltraExpress®? R: El paso de limpieza por fases después de la PCR está diseñado específicamente para reducir el dímero de adaptador; Por favor, siga las instrucciones para este paso tal como están escritas antes de intentar cualquier recomendación adicional. Si aún observa pequeñas cantidades de dímero adaptador en las muestras, recomendamos una limpieza de microesferas SPRI 0.9X después de agrupar las bibliotecas o una mayor optimización de la cantidad de adaptador. P: ¿Se puede usar este kit con adaptadores y cebadores de proveedores distintos a NEB? R: Sí, debería ser posible usar adaptadores y cebadores de proveedores distintos a NEB con este kit NEBNext®. El adaptador debe ser un adaptador con saliente T y el rendimiento final de la biblioteca puede ser ligeramente menor que al usar los adaptadores NEBNext para Illumina®. P: ¿Son la enzima USER incluida en el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress® (tapa azul) y la enzima USER incluida en los conjuntos de cebadores de índice NEBNext (tapa roja) la misma? R: La formulación USER del kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress es más reciente. Sin embargo, todavía se puede usar indistintamente con la versión incluida con el adaptador NEBNext. No hay diferencia en la actividad de la enzima. P: ¿Qué tipos de muestras y calidad son compatibles con el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress®? R: El kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress se ha probado exhaustivamente con ARN de referencia humano universal, una mezcla de ARN bacteriano y ARN extraído de sangre humana completa, pero se espera que sea compatible con diversos tipos de muestras con ARN de buena calidad. Si bien se han producido bibliotecas exitosas utilizando muestras de baja calidad, es necesario optimizar la concentración del adaptador y los ciclos de PCR para lograr bibliotecas de buena calidad. No recomendamos usar <100 ng de ARN total de baja calidad (p. ej., de muestras FFPE) con el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext UltraExpress. Para muestras de ARN altamente fragmentadas y muestras de baja calidad y con bajo aporte, recomendamos usar el kit de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext® Ultra™ II para Illumina® (NEB n.° E7760/E7765). P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reacción Ultra II End Prep? R: Es frecuente ver un precipitado blanco en el tampón de reparación de extremos Ultra II. Si esto ocurre, deje que la mezcla alcance la temperatura ambiente y pipetee el tampón varias veces para disolver el precipitado, seguido de una agitación rápida en vórtex para mezclar. P: ¿El kit incluye adaptador y cebadores? R: No. El kit se puede usar con los oligos multiplex NEBNext para Illumina. Para obtener una lista completa, consulte la Tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit de preparación de bibliotecas. Los manuales específicos de los kits de oligos multiplex también incluyen consejos para configurar las reacciones de PCR. Para conocer las opciones de balance de color, consulte el Selector de oligos de índice NEBNext® para obtener combinaciones de códigos de barras válidas.