New England Biolabs, E3340L, Kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext ULTRAEXPRESS® FS

Categorías relacionadas con NEBNext UltraExpress Preparación de bibliotecas para Illumina, Preparación de bibliotecas de ADN para Illumina, Preguntas frecuentes sobre la preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación P: Al preparar muestras con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® FS, ¿puedo usar soluciones con EDTA para el ADN de entrada? R: Sí, recomendamos que el ADN esté en TE 1X o TE con bajo contenido de EDTA. El ADN también puede estar en Tris 10 mM, pH 7,0-8,0, o H₂O. P: ¿Qué ocurre si se forma un precipitado en el tampón de reacción NEBNext UltraExpress® FS? R: Es habitual ver un precipitado blanco en el tampón NEBNext UltraExpress® FS. Si esto ocurre, deje que la mezcla alcance la temperatura ambiente y pipetee el tampón varias veces para resuspender el precipitado; a continuación, agite rápidamente con un vórtex. P: ¿Es realmente necesario agitar con un vórtex la mezcla enzimática NEBNext UltraExpress® FS? R: Sí, si no se agita la mezcla enzimática NEBNext UltraExpress FS, los resultados pueden variar. P: La reacción de ligadura es muy viscosa. ¿Qué ocurrirá si no se mezcla correctamente? R: Si la reacción de ligadura no se mezcla correctamente, pueden producirse bajos rendimientos de la biblioteca. Para asegurar una mezcla adecuada, la reacción se puede pipetear 10 veces o agitar durante 3 segundos. P: ¿Cuánto material de partida debo usar al preparar bibliotecas con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® FS? R: Este kit es adecuado para 10 ng – 200 ng de ADN de entrada intacto. Para cantidades de entrada fuera de este rango, será necesaria la optimización por parte del usuario final, lo que podría afectar la calidad de la biblioteca. P: ¿Qué tipos de muestras puedo usar con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® FS? R: Las muestras compatibles incluyen ADN genómico humano, microbiano y vegetal de alta calidad, así como ADN plasmídico y amplicón de más de 1 kb. No recomendamos este kit para ADN FFPE. Para ADN FFPE, recomendamos el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultrashear™ FFPE (NEB n.° E6655). P: ¿Puedo usar el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® FS para la conversión con bisulfito y los flujos de trabajo EM-seq™? R: No, el kit NEBNext UltraExpress® FS es incompatible con los flujos de trabajo NEBNext Enzymatic Methyl-seq (EM-seq; NEB n.° E7120) o la conversión con bisulfito. Recomendamos usar NEBNext UltraShear™ (NEB n.° M7634). P: ¿Es posible usar ADN cizallado como material de entrada con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® FS? R: Para entradas de ADN fragmentado, recomendamos usar el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® (NEB n.° E3325) o el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext® Ultra™ II (NEB n.° E7645). El kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® (NEB n.° E3325) admite entradas de 10 ng a 200 ng de ADN fragmentado mecánicamente con un flujo de trabajo de preparación de bibliotecas muy similar al del ADN NEBNext UltraExpress® FS. El kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext® Ultra™ II (NEB n.° E7645) admite entradas de 500 pg a 1 µg con un flujo de trabajo más largo y condiciones personalizadas según la cantidad de ADN. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® FS y el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext® Ultra™ II FS? ¿Cómo elijo el adecuado? R: El kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® FS está optimizado para una preparación de bibliotecas optimizada con una sola concentración de adaptador y un número de ciclo de PCR para muestras dentro del rango de entrada recomendado (10 ng – 200 ng de ADN intacto). El kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext® Ultra™ II FS se ha optimizado exhaustivamente para producir bibliotecas de mayor rendimiento con la máxima calidad. El kit de preparación de bibliotecas de ADN Ultra II FS ofrece condiciones más personalizadas según la cantidad de ADN de entrada, más pasos y limpiezas, un flujo de trabajo más largo y una recomendación de rango de entrada más amplia (0,1 ng – 500 ng de ADN intacto). Ambos kits producen bibliotecas de alta calidad con un alto rendimiento, pero recomendamos elegir NEBNext UltraExpress® FS DNA para muestras dentro del rango de cantidad de entrada indicado, donde la velocidad es fundamental. Recomendamos elegir NEBNext Ultra II FS DNA para muestras más complejas y valiosas (por ejemplo, de baja calidad o bajo aporte). P: ¿Los kits de preparación de bibliotecas NEBNext UltraExpress® incluyen microesferas? R: No, recomendamos usar el kit de reactivos SPRIselect® (Beckman Coulter, Inc. n.° B23317) o las perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.° A63881). P: ¿Qué debo hacer si veo dímeros de adaptador en mis bibliotecas NEBNext UltraExpress®? R: El paso de limpieza por fases después de la PCR está diseñado específicamente para reducir los dímeros de adaptador; siga las instrucciones para este paso tal como están escritas antes de intentar cualquier recomendación adicional. Si aún ve pequeñas cantidades de dímeros de adaptador en las muestras, recomendamos una limpieza con perlas SPRI 0.9X después de agrupar las bibliotecas o una mayor optimización de la cantidad de adaptador. P: ¿Se puede usar este kit con adaptadores y cebadores de otros proveedores que no sean NEB? R: Sí, debería ser posible usar adaptadores y cebadores de otros proveedores que no sean NEB con este kit NEBNext®. El adaptador debe ser un adaptador con saliente T y el rendimiento final de la biblioteca puede ser ligeramente menor que al usar los adaptadores NEBNext para Illumina®. P: ¿Puedo usar el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® FS para preparar bibliotecas para secuenciación en instrumentos Ion Torrent? R: No, los adaptadores necesarios para la secuenciación Ion Torrent tienen extremos romos en lugar de salientes 5'-T y son incompatibles con el flujo de trabajo de ADN UltraExpress FS. P: ¿El reactivo de fragmentación en los kits de ADN NEBNext UltraExpress® FS contiene NEBNext dsDNA Fragmentase®? R: No, los productos de ADN NEBNext UltraExpress® FS (sistema de fragmentación) contienen una mezcla única de enzimas que fragmentan, reparan los extremos y dA ADN de la cola en un solo tubo. La fragmentasa no está incluida en la mezcla de enzimas FS. P: ¿Puede el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® FS proporcionar suficientes rendimientos de biblioteca para el enriquecimiento del objetivo? R: Es posible que se requieran condiciones de ciclado de PCR de biblioteca personalizadas basadas en las cantidades de entrada para producir rendimientos de biblioteca de ~1 µg; Consulte los apéndices del manual del kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext UltraExpress® FS para conocer las condiciones de ciclado de PCR recomendadas.