New England Biolabs, E3350L, Kit enzimático NEBNext® 5hmC-seq

Categorías relacionadas con NEBNext: Detección y análisis de hidroximetilación, Análisis de metilomas, Análisis de metilación del ADN, Especificaciones . Materiales necesarios pero no suministrados: Instrumento Covaris® y los tubos u otro equipo de fragmentación necesarios. Cebadores NEBNext para epigenética (conjunto de índice dual único 2B) NEB n.° E3392S (24 reacciones) o conjunto 3 NEB n.° E3404S (96 reacciones). Tubos de PCR en tiras o placas de 96 pocillos. Formamida (Sigma n.° F9037 - 100 ml), formamida Hi-Di™ (Thermo Fisher Scientific® n.° 4401457) o NaOH 0,1 N. Se prefiere la formamida. Si utiliza NaOH, consulte las preguntas frecuentes en la página de preguntas frecuentes de NEB n.° E3350. 80% Etanol 1X TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), TE bajo (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA) o 10 mM Tris-HCl pH 7,5 u 8,0 Agua libre de nucleasas Soporte/gradilla magnética, como NEBNext Magnetic Separation Rack (NEB #S1515) Bloque de enfriamiento metálico, como Diversified Biotech® (#CHAM-1000) Máquina de PCR Agilent® Bioanalyzer®, TapeStation® u otro analizador de fragmentos y consumibles asociados Preguntas frecuentes P: ¿Qué tipos de muestras se pueden procesar utilizando el kit NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) y el módulo de conversión NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)? R: NEBNext Enzymatic 5hmC-seq se puede usar con ADN genómico, ADN libre de células y ADN FFPE. P: ¿Cuáles son los insumos recomendados para el kit NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) y el módulo de conversión NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)? R: El protocolo se ha optimizado para insumos de entre 0,1 y 200 ng. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3350) y el módulo de conversión NEBNext Enzymatic 5hmC-seq (NEB #E3365)? R: El kit NEBNext Enzymatic 5hmC-seq contiene reactivos para la construcción de bibliotecas NEBNext Ultra™ II y el adaptador E5hmC-seq™, reactivos para la glucosilación de 5hmC y la desaminación de citosina, la mezcla maestra NEBNext Q5U® y microesferas de purificación de muestras. El módulo de conversión enzimática 5hmC-seq se suministra con reactivos para la glucosilación de 5hmC y la desaminación de citosina, y ADN de control. No contiene el adaptador E5hmC-seq, reactivos para la construcción y amplificación de bibliotecas, ni microesferas de purificación de muestras. P: ¿Qué tampones se recomiendan para el cizallamiento de ADN al utilizar el kit NEBNext Enzymatic 5hmC-seq y el módulo de conversión NEBNext 5hmC-seq? R: El ADN debe cizallarse en TE 1X (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), TE bajo (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0) o Tris 10 mM, pH 7,5 u 8,0. No recomendamos usar TE 0,1X (Tris 1 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0) ni agua. P: ¿Cuál es la concentración del adaptador E5hmC-seq™ y de los cebadores índice E5hmC-seq? R: El adaptador E5hmC-seq es de 15 µM y los cebadores índice E5hmC-seq son de 10 µM. mso-generic-font-family:roman; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-536870145 1107305727 0 0 415 0;}@font-face {font-family:Calibri; panose-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:swiss; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-469750017 -1040178053 9 0 511 0;}p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-unhide:no; mso-style-qformat: sí; padre-estilo-mso:""; margen superior: 0 pulgadas; margen derecho: 0 pulgadas; margen inferior: 8,0 pt; margen izquierdo: 0 pulgadas; altura de línea: 107 %; paginación mso: huérfana viuda; tamaño de fuente: 11,0 pt; familia de fuentes: "Calibri", sans-serif; familia de fuentes mso-ascii: Calibri; fuente de tema mso-ascii: latín menor; familia de fuentes mso-fareast: Calibri; fuente de tema mso-fareast: latín menor; familia de fuentes mso-hansi: Calibri; fuente de tema mso-hansi: latín menor; familia de fuentes mso-bidi: "Times New Roman"; fuente de tema mso-bidi: bidi menor;}.MsoChpDefault {mso-style-type:export-only; mso-default-props:yes; tamaño de fuente: 11,0 puntos; mso-ansi-tamaño de fuente: 11.0pt; mso-bidi-tamaño de fuente: 11.0pt; familia de fuentes: "Calibri", sans-serif; familia de fuentes-mso-ascii:Calibri; fuente-tema-mso-ascii: menor-latín; familia de fuentes mso-fareast:Calibri; mso-fareast-theme-font:minor-latin; familia de fuentes mso-hansi: Calibri; mso-hansi-theme-font:minor-latin; mso-bidi-font-family:"Times New Roman"; mso-bidi-theme-font:minor-bidi; mso-font-kerning:0pt; ligaduras mso: ninguna;}. MsoPapDefault {tipo-estilo-mso: solo exportación; margen inferior: 8,0 puntos; line-height:107%;}div.WordSection1 {page:WordSection1;} P: ¿Por qué, en algunas etapas del protocolo E5hmC-seq™, las perlas de purificación de muestras NEBNext® se comportan de forma diferente al limpiar la muestra? R: El comportamiento de las perlas cambia según la limpieza y el paso previo de la reacción E5hmC-seq. El sedimento de perlas se seca rápidamente después de la reacción de glucosilación, por lo que es importante trabajar con rapidez en este paso. Además, durante la limpieza posterior a la PCR, las perlas tienden a aglutinarse con mayor facilidad. No seque demasiado las perlas antes de la elución del ADN, ya que esto puede dificultar la resuspensión de las perlas y reducir potencialmente la recuperación de ADN. P: ¿Cuál es el tamaño esperado de una biblioteca E5hmC-seq™? R: Las bibliotecas E5hmC-seq estándar tienen un tamaño promedio de aproximadamente 500 pb. El tamaño de las bibliotecas puede variar, y las bibliotecas de 400 a 600 pb seguirán funcionando bien. P: ¿Cómo se deben secuenciar las bibliotecas E5hmC-seq™? R: Para la secuenciación con Illumina®, la longitud de lectura se determina en última instancia por el tamaño de la biblioteca y los requisitos del usuario. Las bibliotecas se pueden secuenciar utilizando lecturas de bases de 2x76, 2x100 o 2x150. P: ¿Cómo se deben analizar los datos de secuenciación de E5hmC-seq™? R: En las bibliotecas E5hmC-seq, las 5hmC se secuencian como citosina, mientras que las 5mC y la citosina no metilada se secuencian como timina. Dado que la citosina modificada de interés no se convierte y se secuencia como citosina, se pueden utilizar los procesos establecidos para el análisis de datos EM-seq™ o con bisulfito. También disponemos de un proceso de demostración y datos de ejemplo en la biblioteca de GitHub: https://github.com/nebiolabs/EM-seq/ P: ¿A qué profundidad se deben secuenciar las bibliotecas E5hmC-seq™? R: La profundidad de secuenciación requerida depende de la aplicación del usuario, pero generalmente 30X es una profundidad inicial adecuada. Sin embargo, dado que los niveles de 5hmC pueden ser bajos y difusos en ciertos tipos de muestras, es posible que se requiera una profundidad de 100X o mayor para cuantificar con precisión los niveles de 5hmC. P: ¿Se puede sustituir el adaptador E5hmC-seq™ por otro adaptador? R: No. El adaptador E5hmC-seq ha sido optimizado para su uso con el kit NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq. Los adaptadores modificados para contener bases de 5mC no son compatibles con este flujo de trabajo. P: ¿Se puede utilizar el adaptador E5hmC-seq™ para EM-seq™? R: El adaptador E5hmC-seq ha sido optimizado para su uso en el flujo de trabajo E5hmC-seq. No recomendamos su uso para construir bibliotecas de EM-seq. P: ¿Las bibliotecas E5hmC-seq™ son direccionales o no direccionales? R: Las bibliotecas E5hmC-seq son direccionales. P: ¿Se pueden usar otros tampones en lugar del tampón de elución suministrado? R: El tampón de elución debe usarse cuando se indique en el protocolo, excepto en el caso de almacenamiento a largo plazo de bibliotecas E5hmC-seq™ amplificadas por PCR, en cuyo caso se puede usar TE 1X (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM) o TE baja (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM). P: ¿Qué niveles de conversión son típicos con los ADN de control suministrados? R: Se proporcionan dos controles de ADN: ADN lambda no metilado y ADN T4 5hmC. El ADN T4 5hmC está hidroximetilado en los contextos CpG, CHG y CHH. En el ADN lambda no metilado, se observa típicamente menos del 1% de hidroximetilación, lo que indica una eficiencia de conversión superior al 99%. En el ADN T4 con 5hmC (todas las citosinas están hidroximetiladas), se detecta típicamente más del 96% de 5hmC en los tres contextos de secuencia de citosinas. P: ¿Se puede utilizar ADN fragmentado enzimáticamente en E5hmC-seq™? R: No recomendamos utilizar la mayoría de las mezclas de fragmentación de ADN basadas en enzimas disponibles comercialmente en el flujo de trabajo E5hmC-seq, ya que los procesos de cizallamiento enzimáticos pueden afectar las marcas de metilación en el ADN. Sin embargo, NEBNext UltraShear™ (NEB #M7634) ha sido diseñado específicamente para fragmentar el ADN y conservar las marcas de metilación. Para obtener recomendaciones específicas sobre la combinación de NEBNext UltraShear con NEBNext® E5hmC-seq, póngase en contacto con el soporte técnico de NEB. P: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación en el protocolo E5hmC-seq? R: Sí, se puede usar NaOH, aunque se prefiere la formamida. Si se usa NaOH, es fundamental que la concentración de la solución sea precisa y que el volumen añadido a la reacción sea exactamente de 4 μl. El NaOH es altamente corrosivo. Se deben seguir las normas de seguridad locales e institucionales al trabajar con NaOH. Si se realiza una dilución a partir de NaOH 2 N, asegúrese de que la solución madre tenga un pH mínimo de 12,5. Verifique el pH de la solución madre antes de usarla. Evite diluciones imprecisas preparando un volumen de NaOH diluido lo suficientemente grande como para minimizar los errores de pipeteo. Recomendamos preparar al menos 1 ml. Prepare diluciones de NaOH frescas o almacene alícuotas diluidas a 20 °C hasta por 6 meses para evitar cambios en la concentración. El NaOH sólido es delicuescente (absorbe agua de la atmósfera). No se puede pesar con precisión. Por lo tanto, las soluciones preparadas a partir de pellets de NaOH deben titularse para lograr la concentración adecuada. P: ¿Las bibliotecas E5hmC-seq™ detectan 5mC? R: No, las bibliotecas E5hmC-seq detectan específicamente 5hmC. Además, no se pueden distinguir las citosinas no metiladas del 5mC. Para identificar solo 5mC, los usuarios deben preparar dos bibliotecas y luego realizar un análisis de datos sustractivo. Las bibliotecas EM-seq™ detectan 5mC y 5hmC, mientras que las bibliotecas E5hmC-seq identifican 5hmC. Por lo tanto, restar los datos de E5hmC-seq de los datos de EM-seq proporciona información sobre 5mC. P: ¿Hay hojas de muestra disponibles para usar con los cebadores NEBNext® para epigenética? R: Las hojas de muestra se pueden encontrar en la sección "Instrucciones de uso" de las páginas de producto de NEB n.° E3404S y n.° E3392S. P: ¿Son las bibliotecas de doble indexación compatibles con la secuenciación de extremo único? R: Sí, los oligos NEBNext para Illumina, incluidos los oligos de doble índice, son compatibles con la secuenciación de lectura única. Consulte la Guía general de secuenciación indexada de Illumina (versión actual) para obtener información sobre los flujos de trabajo de secuenciación de doble índice en una celda de flujo de lectura única o en una celda de flujo de extremo emparejado. P: ¿El kit incluye cebadores? R: No. El kit se puede utilizar con los cebadores de doble índice únicos NEBNext LV. Para obtener una lista completa de cebadores de doble índice únicos de bajo volumen (LV), consulte la tercera columna de la Tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit. Los manuales de los cebadores de doble índice únicos NEBNext LV también incluyen consejos para configurar las reacciones de ligadura. Para obtener información sobre las opciones de equilibrio de color, consulte el Selector de oligos de índice NEBNext® para ver las combinaciones de códigos de barras válidas.