New England Biolabs, E3410S, Kit de cuantificación de biblioteca NEBNext® para Ultima Genomics®

Categorías relacionadas con NEBNext Cuantificación de bibliotecas NGS, Secuenciación de próxima generación Preguntas frecuentes sobre la preparación de bibliotecas P: ¿Qué es el NEBNext® Library Quant Kit para Ultima Genomics® (NEB n.º E3410)? R: El NEBNext Library Quant Kit para Ultima Genomics es un ensayo especializado basado en qPCR para cuantificar con precisión bibliotecas de secuenciación de próxima generación (NGS) sin PCR preparadas mediante el flujo de trabajo UG 100 SolarisTM Free. P: ¿Cuáles son las ventajas del NEBNext® Library Quant Kit para Ultima Genomics® (NEB n.º E3410) basado en qPCR en comparación con otros métodos de cuantificación de bibliotecas NGS? R: La qPCR se considera el método más preciso y eficaz de cuantificación de bibliotecas. La consistencia y la reproducibilidad de la cuantificación son considerablemente mayores con la qPCR que con la electroforesis o la espectrofotometría, que miden la concentración total de ácidos nucleicos. Los métodos basados ​​en amplificación cuantifican únicamente las moléculas que contienen ambas secuencias adaptadoras, lo que proporciona una estimación más precisa de la concentración de la biblioteca que se puede secuenciar. Dado que los experimentos de qPCR pueden configurarse en placas de 96 pocillos, también son más adaptables a flujos de trabajo de alto rendimiento. En comparación con otros métodos de qPCR, se han incorporado varias mejoras adicionales al NEBNext Library Quant Kit para Ultima Genomics para mayor comodidad: se puede utilizar un único tiempo de extensión para todas las bibliotecas, independientemente de su tamaño. Luna® Universal qPCR Master Mix está formulada para requerir únicamente la adición de cebadores (no se requiere pipeteo adicional para añadir agua a cada reacción). Luna Universal qPCR Master Mix contiene un colorante de referencia pasivo universal, lo que elimina la necesidad de añadir ROX incluso en instrumentos en tiempo real que requieren normalización de ROX. El NEBNext Library Quant Kit para Ultima Genomics incluye un práctico tampón de dilución de biblioteca concentrado. P: ¿Cuánto debo diluir mi biblioteca para analizarla en el kit NEBNext® Library Quant para Ultima Genomics® (NEB n.° E3410)? R: Las bibliotecas deben diluirse a una concentración dentro del rango dinámico de los estándares proporcionados en el kit NEBNext® Library Quant para Ultima Genomics® (0,003 pM-30 pM). Una dilución inicial típica está entre 1:4000 y 1:10 000, pero puede que sea necesario realizar ajustes según la concentración inicial de su biblioteca. P: ¿Cuál es la duración del flujo de trabajo del kit NEBNext® Library Quant? R: El flujo de trabajo del kit NEBNext® Library Quant dura aproximadamente 1 h 50 min. De este tiempo, aproximadamente 50 min corresponden al tiempo de manipulación y 1 h corresponde al tiempo de máquina empleado en la analítica qPCR. P: ¿Ofrecen herramientas de análisis para facilitar la cuantificación al utilizar el kit NEBNext® Library Quant para Ultima Genomics® (NEB n.° E3410)? R: Sí, NEB proporciona herramientas de software y plantillas para facilitar el análisis y la cuantificación de bibliotecas mediante el kit NEBNext Library Quant para Ultima Genomics, lo que simplifica el procesamiento de datos y la interpretación de resultados. La herramienta de análisis se encuentra en la sección NGS Library Quant de NEBioCalculator. P: ¿Es necesario corregir el tamaño del quant de la biblioteca al utilizar el kit NEBNext® Library Quant para Ultima Genomics® (NEB n.° E3410)? R: Sí. El colorante intercalante utilizado en el kit NEBNext Library Quant para Ultima Genomics se une al ADN proporcionalmente al número de pares de bases por producto de ADN bicatenario, por lo que es necesario corregir la longitud del producto normalizándolo al tamaño del estándar de ADN, 200 pb. Todos los quants se multiplican simplemente por un factor de corrección de 200/tamaño de la biblioteca. Esto se realiza automáticamente mediante nuestra herramienta en línea para NGS Library Quant. P: ¿Cuántas bibliotecas puedo cuantificar simultáneamente con el kit NEBNext® Library Quant para Ultima Genomics® (NEB n.° E3410)? R: Recomendamos realizar dos diluciones de cada biblioteca por triplicado durante la etapa de desarrollo/optimización. Por lo tanto, se pueden cuantificar 12 bibliotecas en una placa de 96 pocillos utilizando 5 estándares y 1 control sin molde (NTC). Una vez establecido el flujo de trabajo, se puede realizar una sola dilución, lo que permite cuantificar 24 bibliotecas por placa de 96 pocillos utilizando 5 estándares y 1 NTC. P: ¿Qué otros materiales o información necesito para ejecutar el kit NEBNext® Library Quant? R: Es necesario conocer el tamaño promedio de la biblioteca, por lo que resulta útil el análisis con un bioanalizador Agilent, TapeStation o un instrumento similar. Se proporciona un tampón de dilución de biblioteca concentrado que debe diluirse con agua sin nucleasas. Se requiere un instrumento de qPCR con placas y sellos adecuados, así como equipo de laboratorio estándar como pipetas, puntas y tubos cónicos. P: ¿Debo añadir ROX al utilizar el kit NEBNext® Library Quant para Ultima Genomics® (NEB n.° E3410)? R: No. Luna® Universal qPCR Master Mix contiene un colorante de referencia pasivo universal que permite la compatibilidad con diversos instrumentos en tiempo real, incluyendo aquellos que no utilizan normalización de referencia pasiva y aquellos que utilizan una cantidad baja o alta de colorante de referencia pasivo (ROX). P: ¿Puedo utilizar el kit NEBNext® Library Quant para Ultima Genomics® (NEB n.° E3410) en mi equipo de qPCR? R: El kit NEBNext Library Quant para Ultima Genomics se ha probado y es compatible con los siguientes instrumentos de qPCR, utilizando protocolos estándar o de rampa de temperatura rápida: Bio-Rad CFX96TM Touch, Applied Biosystems® 7500, Fast Life Technologies QuantStudioTM 6. Las estimaciones de la eficiencia de amplificación pueden variar entre los instrumentos de qPCR debido a las diferencias en el hardware y el software de análisis. P: ¿Es el kit NEBNext® Library Quant para Ultima Genomics® (NEB n.° E3410) compatible con los flujos de trabajo Solaris Free y Flex en la plataforma Ultima Genomics? R: El kit NEBNext Library Quant para Ultima Genomics es compatible con bibliotecas preparadas con el flujo de trabajo UG SolarisTM Free. Para las bibliotecas preparadas con el flujo de trabajo UG Solaris Flex, se recomienda utilizar métodos de cuantificación alternativos.