Kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeñas de bajo sesgo NEBNext®, E3420L, de New England Biolabs

Cuando es importante ver la imagen completa de las especies de ARN pequeño en una muestra, solo hay un kit de preparación de bibliotecas que realmente cumple la promesa de ser de bajo sesgo. El kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño NEBNext de bajo sesgo fue diseñado para generar bibliotecas que reflejan con precisión las proporciones relativas de las especies de ARN presentes en una muestra. El sencillo protocolo sin gel con un amplio rango de entrada hace de este kit el kit de alta sensibilidad más rápido para la preparación de bibliotecas de ARN pequeño en el mercado. Categorías relacionadas Preparación de bibliotecas de ARN pequeño,, Preguntas frecuentes sobre la preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación P: ¿Cuál es la formulación de 0.1X TE proporcionada con el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño NEBNext de bajo sesgo? R: El 0.1X TE proporcionado con el kit es 1 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA. P: ¿Las bibliotecas generadas con el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño NEBNext de bajo sesgo son compatibles con la secuenciación de Illumina de extremos emparejados? R: Sí, las bibliotecas preparadas con este protocolo se pueden secuenciar con lecturas de extremos emparejados. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de los insertos, una lectura de extremo único de 56 pb suele ser suficiente, y una segunda lectura sería redundante. P: ¿Cuáles son las secuencias necesarias para recortar las bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext? R: Las siguientes secuencias se pueden utilizar para recortar las bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext: Lectura 1 AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA Lectura 2 AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT P: ¿Se necesitan cebadores de secuenciación personalizados para secuenciar las bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext? R: No. Las bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext son compatibles con los reactivos de secuenciación de Illumina; por lo tanto, no es necesario diseñar secuencias de cebadores personalizados. P: ¿Cuándo se hibrida el cebador RT durante el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext (NEB n.° E3420)? R: El kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext no incluye un cebador RT independiente. El cebador RT se genera a partir de la hebra inferior del adaptador LB 3' de NEBNext durante la reacción de ligación del adaptador LB 5' de NEBNext. P: ¿Qué debo hacer si mi ARN no tiene extremos 5' monofosfato ni 3' OH antes de iniciar el flujo de trabajo de preparación de bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext (NEB n.° E3420)? R: T4 PNK puede añadir 5' monofosfato a un 5' OH y eliminar el fosfato 3', generando un 3' OH. Otras modificaciones, como las tapas o los pirofosfatos, deben eliminarse con otras enzimas. Para obtener recomendaciones, contacte con el soporte técnico de NEB (info@neb.com). P: ¿Es posible evitar la inclusión de ARN abundantes e indeseados en las bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext (NEB n.° E3420)? R: El kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext captura todos los ARN pequeños de menos de ~120 nt con extremos 5' monofosfato y 3' OH, independientemente de su origen. P: ¿Puedo usar ARN total como entrada en el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext (NEB n.° E3420) o necesito aislar o enriquecer específicamente para ARN pequeños? R: Tanto el ARN total como el ARN pequeño enriquecido se pueden usar como entradas en el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext. P: ¿Cuáles son los rendimientos típicos de una biblioteca de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext (NEB n.° E3420)? R: En general, el ARN total disponible comercialmente de cerebro humano (RIN > 7; 1000 ng; 9 ciclos de PCR) obtenido a través de la Sección 8A del Manual del Producto (Selección de Tamaño) puede producir bibliotecas finales de 30 a 60 nM, mientras que la misma entrada obtenida a través de la Sección 8B del Manual del Producto (Limpieza) puede producir bibliotecas finales de 60 a 120 nM. Factores como la muestra, el contenido de ARN pequeño, la integridad del ARN y el número de ciclos de PCR afectarán los rendimientos finales de la biblioteca. P: ¿Qué importancia tiene el volumen de isopropanol en el protocolo del NEBNext Low-bias Small RNA Library Prep Kit (NEB #E3420)? R: La adición correcta de isopropanol durante la Sección 6 del Manual del Producto (Selección de Tamaño) es esencial para la unión del ADNc de la biblioteca de ARN pequeño a las perlas de purificación de muestras NEBNext. Recomendamos humedecer previamente las puntas de las pipetas para la adición de isopropanol. P: ¿Puedo seleccionar el tamaño del gel en las bibliotecas finales generadas con el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext (NEB n.° E3420)? R: El kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext se ha optimizado para eliminar la necesidad de purificar el gel de la biblioteca final. Sin embargo, si prefiere aislar su biblioteca mediante la selección del tamaño del gel, puede limpiar la reacción de PCR siguiendo las instrucciones de la Sección 8B del Manual del producto (Limpieza) y seleccionar el tamaño del gel en un gel PAGE al 6 %. P: ¿Cuál es el RIN necesario para el ARN total que se utilizará en la generación de la biblioteca de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext (NEB n.° E3420)? R: El kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext genera bibliotecas de ARN pequeño de alta calidad a partir de ARN total de alta calidad, así como de muestras degradadas (como FFPE). Este kit se ha probado en muestras de RIN ~2.2 – 10. Al trabajar con muestras de baja calidad y altamente degradadas, el kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño de bajo sesgo NEBNext capturará todos los ARN pequeños menores de ~120 nt, independientemente de su origen, que tengan extremos 5' monofosfato y 3' OH. P: ¿El kit incluye cebadores? R: No. El kit se puede utilizar con los cebadores de doble índice único NEBNext LV. Para obtener una lista completa de cebadores de doble índice único de bajo volumen (LV), consulte la tercera columna de la tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit de preparación de bibliotecas. Los manuales de los cebadores de doble índice único NEBNext LV también contienen consejos para configurar las reacciones de ligación. Para obtener opciones de equilibrio de color, consulte el selector de oligos de índice NEBNext® para obtener combinaciones de códigos de barras válidas.