New England Biolabs, E3436S, módulo de cebador de indexación integrado NEBNext Flu A

El módulo de cebadores de indexación integrados NEBNext Flu A está diseñado para su uso en la síntesis, amplificación y preparación de bibliotecas de ADNc antes de la secuenciación de la influenza A (gripe A). Las bibliotecas generadas con el módulo de cebadores están diseñadas para la secuenciación con Oxford Nanopore Technologies. Categorías relacionadas: Enfermedades infecciosas y secuenciación ARTIC, secuenciación de la influenza, secuenciación de próxima generación, preguntas frecuentes sobre la preparación de bibliotecas. P: ¿Qué reactivos adicionales se necesitan para la síntesis y amplificación de ADNc con el módulo de cebadores de indexación integrados NEBNext Flu A (NEB n.° E3436)? R: NEB recomienda combinar el módulo de cebadores de indexación integrados NEBNext Flu A con el kit LunaScript® Multiplex One-Step RT-PCR (NEB n.° E1555). Puede encontrar un protocolo para el uso de estos reactivos para la generación de amplicones de la gripe A aquí. P: ¿Dónde puedo encontrar secuencias del cebador de indexación integrado NEBNext Flu A (NEB n.° E3436)? R: Las secuencias de cebadores de indexación integrada NEBNext Flu A se pueden encontrar aquí: https://github.com/nebiolabs/NEBNextFluA. P: ¿Qué cepas de gripe A pueden identificarse con los cebadores de indexación integrada NEBNext Flu A (NEB n.° E3436)? R: La característica universal de los cebadores de este kit, que se dirigen a la gripe A, puede utilizarse para la identificación y secuenciación de diversas cepas de gripe A, como H3N2, H1N1 y H5N1, de diversas fuentes hospedadoras (p. ej., humana, aviar, bovina, etc.). P: ¿Qué reactivos y protocolos de preparación de bibliotecas pueden utilizarse para secuenciar amplicones de ADNc generados con el módulo de cebadores de indexación integrada NEBNext Flu A (NEB n.° E3436)? R: Los índices integrados añadidos a los amplicones de ADNc de gripe A son compatibles con la secuenciación de lectura larga en plataformas ONT y protocolos de demultiplexación de código de barras nativo de ONT. El protocolo y los reactivos necesarios para secuenciar amplicones NEBNext de Flu A en las plataformas de Oxford Nanopore Technologies también se pueden encontrar aquí. Si los amplicones de ADNc (de 900 pb a 2500 pb de longitud) se fragmentan y se tratan como entradas de ADN no indexadas, pueden utilizarse en secuenciaciones de lectura corta. Para la secuenciación de lectura corta en plataformas Illumina, NEB recomienda combinar el Módulo de Cebadores de Indexación Integrados NEBNext de Flu A con el Kit de RT-PCR Multiplex de un solo paso LunaScript® (NEB n.° E1555), el Kit de Preparación de Bibliotecas de ADN NEBNext UltraExpress® FS (NEB n.° E3340) y los Oligonucleótidos Multiplex NEBNext® para Illumina® (Conjunto de 96 pares de cebadores de índice dual únicos 1-5) (consulte neb.com/oligos). Siga las instrucciones de la Sección 1 del manual del Módulo de Primer de Indexación Integrado NEBNext Flu A para generar ADNc y, a continuación, siga el manual del Kit de Preparación de Bibliotecas de ADN UltraExpress® FS para preparar las bibliotecas de Flu A de Illumina. P: ¿Existe un rango de valores de Ct recomendado para las entradas de Flu A al utilizar el Módulo de Primer Integrado NEBNext Flu A (NEB n.º E3436)? R: NEB recomienda entradas de al menos 1000 copias del genoma. Dado que los valores de Ct varían según el tipo de ensayo y el genoma diana del ensayo, no disponemos de un rango de valores de Ct específico. P: ¿Cuál es la profundidad de lectura mínima necesaria para la secuenciación de Flu A al utilizar el Módulo de Primer Integrado NEBNext Flu A (NEB n.º E3436)? R: Para la secuenciación de ONT en una celda de flujo MinION, NEB recomienda una profundidad de lectura mínima de 100 000 lecturas por biblioteca de Flu A. Para la secuenciación de Illumina, NEB recomienda una profundidad de lectura mínima de 0,5 M lecturas de PE por biblioteca de Flu A. P: ¿Con qué tipos de muestras se puede utilizar el Módulo de Cebadores de Indexación Integrados NEBNext Flu A (NEB n.° E3436)? R: Los protocolos para usar el Módulo de Cebadores de Indexación Integrados NEBNext Flu A se han validado con plantillas de ARNg de alta calidad disponibles comercialmente. Otros tipos de muestras que se han probado incluyen aislados de ARN de cultivos celulares y ARN extraído de muestras clínicas (p. ej., hisopos nasofaríngeos). P: ¿Qué métodos de extracción se recomiendan para usar en el flujo de trabajo de secuenciación de NEBNext Flu A cuando se utiliza el Módulo de Cebadores Integrados NEBNext Flu A (NEB n.° E3436)? R: Se recomienda el ARN aislado con el Kit de Extracción de ADN/ARN Viral Monarch® Mag (NEB n.° T4010S) y el Kit de Aislamiento de ARN Monarch® Spin (Mini) (NEB n.° T2110) de NEB. También se pueden utilizar otros métodos de extracción de ARN basados ​​en microesferas y columnas. P: Los kits ONT SQK-LSK114 incluyen microesferas AMPure® XP, pero ¿se necesitan microesferas adicionales para ejecutar el flujo de trabajo de preparación de bibliotecas ONT® del módulo de cebadores de indexación integrado NEBNext Flu A (NEB n.° E3436)? R: A partir de finales de 2025, los kits ONT® SQK-LSK114 incluyen 1200 µl de microesferas AMPure XP, un volumen suficiente para ejecutar el flujo de trabajo de preparación de bibliotecas ONT® del módulo de cebadores de indexación integrado NEBNext Flu A. Los kits SQK-LSK114-XL no incluyen microesferas de purificación de muestras.