Kit de RT-PCR OneTaq®, E5310S, New England Biolabs

RT-PCR de dos pasos fácil y eficiente Categorías relacionadas RT-PCR,, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas Aplicaciones RT-PCR,, RT-PCR y síntesis de ADNc,, PCR multiplex, Preguntas frecuentes P: ¿Por qué tengo un bajo rendimiento del producto de PCR? R: Hay varias cosas que pueden mejorar los rendimientos: Verifique el diseño del cebador usando un software de computadora. Optimice la temperatura de hibridación en un paso de 1-2 °C. Una concentración de cebador de 0,2 μM es satisfactoria para la mayoría de las reacciones de PCR. Sin embargo, la sensibilidad y el rendimiento de las reacciones de RT-PCR se pueden mejorar aumentando la concentración del cebador por encima de 0,5 μM. Una concentración de cebador más baja entre 0,07 μM y 0,2 μM puede mejorar la especificidad. Aumente el número de ciclos hasta 45 ciclos. Haga un arranque en caliente manual. Use tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml. Pruebe un protocolo de PCR touch-down (4). P: ¿Por qué obtengo un bajo rendimiento de ADNc? A: Hay varias posibilidades: Verifique la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante (2). El ARN debe tener una relación mínima A260/A280 de 1,7 o superior. La precipitación con etanol seguida de un lavado con etanol al 70% puede eliminar la mayoría de los contaminantes, como EDTA y guanidinio. La precipitación con cloruro de litio puede eliminar polisacáridos (2). La extracción con fenol/cloroformo y la extracción con etanol pueden eliminar proteínas contaminantes, como las proteasas (2). Algunos ARN diana pueden contener pausas fuertes para la RT; utilice cebado aleatorio en lugar de d(T)23VN. Utilice una cantidad suficiente de ARN. P: ¿Por qué veo productos de tamaño incorrecto? R: Podría haber varias razones: La presencia de un producto de PCR más grande de lo esperado a menudo se debe a la contaminación del ADN genómico. Trate con DNasa I antes de la síntesis de ADNc (5). La presencia de un producto de PCR del tamaño correcto en el control negativo -RT se debe a la contaminación del ADN genómico o a un producto de PCR remanente. Utilice áreas separadas para el ensamblaje de la reacción y el análisis del producto. Utilice cebadores que abarquen el límite exón-exón. Los productos de PCR inespecíficos pueden eliminarse optimizando las reacciones de PCR. Esto implica lo siguiente: (1) comprobar los cebadores con un programa informático, (2) aumentar las temperaturas de hibridación en incrementos de 1 °C y (3) reducir la concentración del cebador a 75 nm.