New England Biolabs, E5315S, Kit de RT-PCR OneTaq® de un solo paso

RT-PCR de un solo paso fácil y eficiente Categorías relacionadas RT-PCR,, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas Aplicaciones RT-PCR,, RT-PCR y síntesis de ADNc,, PCR Preguntas frecuentes P: ¿Cómo elijo entre los protocolos de RT-PCR de un solo paso y RT-PCR de dos pasos? R: Los protocolos de RT-PCR de un solo paso y de dos pasos ofrecen una detección robusta de dianas de ARN. Dependiendo de su diseño experimental y objetivos, puede preferir un protocolo sobre el otro. Consulte la siguiente tabla: P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB #E6560 y NEB #E5315? R: Ambos kits utilizan la transcriptasa inversa ProtoScript II para la síntesis de ADNc de primera cadena. La transcriptasa inversa ProtoScript II es una transcriptasa inversa M-MuLV mutante con actividad de ARNasa H reducida y mayor termoestabilidad. NEB #E6560 es un kit para la síntesis de ADNc de primera cadena; Su producto puede usarse para análisis de PCR o qPCR posteriores. NEB #E5315 es un kit de RT-PCR de un solo paso; su producto es un producto de PCR de dsADN específico. P: ¿Cómo funciona el protocolo del kit de RT-PCR de un solo paso para NEB #E5315? R: Las reacciones de RT-PCR de un solo paso permiten tanto la síntesis de ADNc como la amplificación por PCR en el mismo tampón de reacción. Se programa un termociclador para que primero se produzca la síntesis de ADNc (48 °C durante 15 minutos), luego se inactive la transcriptasa inversa mientras se activa la Taq polimerasa Hot Start (94 °C durante 1 minuto), seguido de 40 ciclos de amplificación por PCR. P: ¿Puedo usar un volumen de reacción de 25 μl en lugar de 50 μl con NEB #E5315? R: Sí, puede usar una reacción de 25 µl reduciendo los volúmenes de reactivo a la mitad. P: ¿Qué condiciones debo usar para la síntesis de ADNc? R: Recomendamos usar una temperatura de síntesis de ADNc en el rango de 42 °C a 55 °C durante 15-30 minutos. Rutinariamente, usamos 48 °C durante 15 minutos. P: ¿Necesito optimizar los componentes de la reacción? R: Las condiciones de reacción estándar del kit OneTaq One-Step RT-PCR (1,6 mM de MgCl₂ y 250 µM de dNTP a 1X) funcionan bien para la mayoría de los objetivos. Es posible que pueda agregar más MgCl₂ o dNTP para que sus reacciones funcionen mejor, pero en la mayoría de los casos, rediseñar sus cebadores puede ser más efectivo. P: ¿Cuánta plantilla de ARN debo usar? R: Las plantillas de ARN pueden ser ARN total, ARNm o ARN sintetizado por transcripción in vitro. Como regla general, se puede usar hasta 1 μg de plantilla de ARN en una reacción de 20 µl. P: ¿Cómo debo diseñar mis cebadores? R: Recomendamos seguir las pautas generales para el diseño de cebadores de PCR: los cebadores suelen tener una longitud de 20 a 40 nucleótidos, con un contenido de GC del 40 al 60 %, y los pares de cebadores no deben compartir secuencias complementarias en el extremo 3'. P: ¿Cuál es la concentración de cebador recomendada? R: Para la mayoría de los objetivos, los cebadores de 200 nM a 400 nM funcionan bien. Es posible que desee titular la concentración de cebador en el rango de 100 nM a 800 nM. P: ¿Cuántos ciclos de PCR debo hacer? R: Recomendamos 40 ciclos para la mayoría de los objetivos. Algunos objetivos de ARN abundantes se pueden detectar con tan solo 25 ciclos. P: ¿Cómo elijo entre LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR Kit y OneTaq One-Step RT-PCR Kit (NEB n.º E5315)? R: Ambos kits permiten la RT-PCR de un solo paso. Consulte la siguiente tabla como guía para elegir entre el kit LunaScript y el kit OneTaq One-Step RT-PCR (NEB n.° E5315).