New England Biolabs, E5360L, sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress®

Categorías relacionadas con NEBExpress NEBExpress, ®, Cell-free, E. coli, Protein Synthesis System,, Cell-free Protein Expression,, Protein Applications NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System,, High-throughput cloning and automation solutions,, Cell-free Protein Expression, FAQ P: Según mi aplicación, ¿debería utilizar el NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System (NEB #E5360) o el PURExpress® In Vitro Protein Synthesis Kit (NEB #E6800)? R: Tanto el NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System como el PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit son adecuados para la síntesis de proteínas de alto rendimiento de una variedad de dianas proteicas, bajo el control de la ARN polimerasa T7. Ambos productos ofrecen un cómodo análisis de reacción mediante SDS-PAGE o mediante ensayo directo. Ambos sistemas son compatibles con plantillas de ADN plasmídico y lineal; El ARNm también puede usarse como plantilla. PURExpress es un sistema reconstituido y, por lo tanto, proporciona un entorno de reacción más definido con mínima actividad de nucleasas y proteasas. Aplicaciones posteriores, como la evolución dirigida de proteínas, estudios de traducción e interacciones proteína-proteína, son especialmente adecuadas para PURExpress. PURExpress también es ideal para aplicaciones donde se excluyen selectivamente componentes de la maquinaria traduccional (Kit PURExpress Δ (aa, ARNt), Kit PURExpress Δ RF123, Kit PURExpress Δ Ribosome), incluyendo la incorporación de aminoácidos no naturales, el radiomarcaje y los estudios de ribosomas. En PURExpress, todos los componentes proteicos (excepto los ribosomas) son recombinantes y están marcados con His, lo que permite la purificación inversa. El sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress® es preferible para aislar proteínas marcadas con His. Además, tiene un menor coste por reacción, lo que lo hace más fácilmente escalable a aplicaciones de gran volumen. Para comparar PURExpress y el sistema de síntesis de proteínas de E. coli acelular NEBExpress® por aplicación, consulte la tabla de aplicaciones en la pestaña de herramientas y recursos. P: ¿Cuál es la diferencia entre el sistema de síntesis de proteínas de E. coli acelular NEBExpress® y el kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress? R: El kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress® es un sistema de síntesis de proteínas reconstituido donde todos los componentes necesarios para la transcripción y traducción in vitro (incluida la ARN polimerasa T7) se purifican a partir de E. coli y se mezclan en una solución multicomponente. Todos los componentes proteicos están marcados con His (excepto el ribosoma). PURExpress® contiene mínimas actividades de nucleasa y proteasa. La mezcla de proteínas se combina con un tampón de reacción optimizado para la transcripción y traducción acopladas. El sistema de expresión de E. coli acelular NEBExpress® es un lisado de alta actividad de E. coli que, en combinación con un tampón de reacción optimizado, la ARN polimerasa T7 y un inhibidor de ARNasa, permite la transcripción y traducción acopladas. Ambos sistemas son compatibles con plantillas de ADN plasmídico y lineal; el ARNm también puede utilizarse como plantilla. Para comparar PURExpress y el sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress® por aplicación, consulte la tabla de aplicaciones en la pestaña de herramientas y recursos. P: ¿Son comparables los rendimientos del sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress® con los del kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress? R: El rendimiento proteico, utilizando tanto el kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress como el sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress, depende de la naturaleza de la proteína diana y de las condiciones de reacción. El sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress produce habitualmente hasta 0,5 mg/ml (hasta 25 μg por 50 μl de reacción). El sistema PURExpress produce habitualmente hasta 0,25 mg/ml (hasta 12,5 μg por 50 μl de reacción). Las condiciones para un objetivo determinado requerirán la optimización de la temperatura y el tiempo de incubación, así como de la concentración del molde y los suplementos. P: ¿Puedo expresar proteínas grandes con el sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress? R: El sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress puede producir dianas de alto peso molecular gracias a la estabilización del molde de ARNm en un entorno con baja concentración de ARNasa. Se han sintetizado con éxito proteínas de 17 a 230 kDa en forma activa (resultados no publicados). Por ejemplo, una proteína de 230 kDa funcionalmente activa, la β-galactosidasa de Streptococcus, se expresó utilizando el sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress. P: ¿Puedo utilizar el sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress para incorporar aminoácidos artificiales o radiomarcados? R: Para estas aplicaciones, el kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress® (NEB n.° E6800) es la mejor opción. P: ¿Se puede escalar la reacción a volúmenes menores o mayores? R: Sí, el volumen de reacción típico es de 50 µl, pero se puede aumentar o disminuir linealmente. Todos los componentes de la reacción, incluido el molde de ADN, deben escalarse proporcionalmente. El sistema se ha probado con volúmenes de reacción desde 1 µl hasta 2 ml. Los rendimientos de síntesis de proteínas son comparables dentro de este rango. Para volúmenes pequeños, como 1 µl, se debe utilizar un manipulador de líquido con eyección acústica de gotas (o similar). Para volúmenes grandes, utilice un recipiente con suficiente espacio de cabeza para permitir la aireación e incube con agitación. P: ¿Qué métodos se pueden utilizar para purificar la proteína sintetizada? R: Se puede aplicar cualquier método de purificación por afinidad, ya que ninguna de las proteínas endógenas del sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress está marcada. Si la proteína sintetizada contiene una etiqueta His, se pueden utilizar las perlas magnéticas NEBExpress Ni-NTA (NEB #S1423), las columnas de centrifugación NEBExpress Ni (NEB #S1427) o la resina NEBExpress Ni (NEB #S1428). Si la proteína sintetizada contiene una etiqueta de proteína de unión a maltosa (MBP), se puede utilizar la resina de amilosa (NEB #E8021), la resina de amilosa de alto flujo (NEB #E8022) o las perlas magnéticas de amilosa (NEB #E8035). Si la proteína sintetizada tiene una etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), se puede utilizar la resina de quitina (NEB #S6651) o las perlas magnéticas de quitina (NEB #E8036). P: ¿Puedo coexpresar diferentes dianas proteicas de diferentes plásmidos? R: Sí, se puede expresar más de una diana en una sola reacción; los rendimientos son similares a los observados cuando cada proteína se expresa de forma independiente. P: ¿Necesito purificar mi plásmido o plantilla de ADN lineal antes de la síntesis? R: La pureza de la plantilla es importante para una transcripción/traducción in vitro exitosa; recomendamos el kit Monarch® Spin Plasmid Miniprep (NEB #T1110) o el kit Monarch® Spin PCR & DNA Cleanup (5 μg) (NEB #T1130) para aislar el plásmido o ADN lineal. Además, recomendamos usar una concentración de plantilla de ADN ≥100 ng/µl. P: ¿Se expresan los genes bajo el control del promotor bacteriano con el sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress®? R: Aunque la ARN polimerasa endógena de E. coli está presente en el lisado celular, la expresión de genes bajo el control de los promotores bacterianos será mínima. La producción de proteínas será muy baja en comparación con la alta síntesis de proteínas impulsada por la ARN polimerasa T7. P: ¿Qué sistemas ofrece NEB para la expresión y purificación de proteínas? A: El sistema de fusión y purificación de MBP NEBExpress® (NEB# E8201) aprovecha el potente promotor Ptac y las señales de iniciación de la traducción de la proteína de unión a maltosa (MBP) para mejorar la solubilidad y los niveles de expresión de la proteína deseada en E. coli. El producto resultante es una proteína de fusión de MBP, que se purifica y aísla en dos sencillos pasos: elución de amilosa, escisión con la proteasa TEV y aislamiento con resina de Ni, lo que da como resultado una proteína diana de alta pureza sin etiqueta. El sistema IMPACT™ (NEB# E6901) utiliza elementos de empalme de proteínas diseñados (inteínas) para purificar proteínas recombinantes mediante una única columna de afinidad de quitina. Este sistema se distingue de otros sistemas de fusión de proteínas por su capacidad para separar una proteína recombinante de la etiqueta de afinidad sin el uso de una proteasa. Además, las proteínas recombinantes nativas que poseen un tioéster C-terminal pueden aislarse para aplicaciones como la semisíntesis de proteínas y el marcaje específico de sitio. El kit de expresión de proteínas de K.lactis (NEB# E1000) proporciona un método sencillo para expresar un gen de interés en la levadura Kluyveromyces lactis. Las proteínas pueden producirse intracelularmente o secretarse mediante el vector de expresión integrativo pKLAC1 incluido. El kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress® (NEB# E6800) es un sistema de transcripción/traducción acelular de E. coli reconstituido a partir de componentes purificados. Los factores de transcripción/traducción de E. coli (excepto los ribosomas) están marcados con His. La proteína diana puede expresarse a partir de plantillas de ADN lineal o plasmídico que contienen un promotor T7. El sistema de síntesis de proteínas de E. coli acelular NEBExpress™ (NEB #E5360) es un sistema basado en extractos derivados de células de E. coli, diseñados para la producción in vitro de alto nivel de proteína recombinante a partir de genes clonados aguas abajo de un promotor T7 en plantillas de ADN lineal o plasmídico. El aislamiento eficiente de la proteína diana recombinante se puede lograr mediante el uso de perlas magnéticas de Ni-NTA NEBExpress (NEB #S1423), columnas de centrifugación (NEB #S1427) o resina (NEB #S1428). Perlas magnéticas de Ni-NTA NEBExpress™ (NEB #S1423), columnas de centrifugación de Ni NEBExpress™ (NEB #S1427) y resina de Ni NEBExpress™ (NEB #S1428): una gama de productos de níquel inmovilizado para el aislamiento de proteínas marcadas con polihistidina (marcadas con His) a partir de lisados ​​celulares o reacciones de síntesis de proteínas acelulares. P: ¿La proteína diana se mantendrá estable durante la incubación de la síntesis a 37 °C? R: Aunque este es un sistema basado en extracto celular, el nivel de proteasa es mínimo. El producto proteico se mantiene estable durante la síntesis hasta que la reacción se completa y está listo para el análisis o la purificación posterior. Las reacciones también se pueden almacenar a -20 °C para su posterior análisis. P: Tras la reacción de síntesis de proteínas acelulares NEBExpress, ¿cómo debo analizar la proteína? ¿Es posible utilizar SDS-PAGE nativo u otros ensayos funcionales para determinar la actividad de la proteína expresada? R: Las reacciones de síntesis de proteínas in vitro producidas por el sistema de síntesis de proteínas de E. coli acelulares NEBExpress se pueden cargar directamente en geles de SDS-PAGE nativos o desnaturalizantes sin necesidad de precipitación con acetona o TCA. Las reacciones también se pueden analizar directamente, sin purificación de proteínas, en ensayos funcionales (enzimáticos, colorimétricos, fluorescentes, en gel, etc.), siempre que los componentes de la síntesis de proteínas (nucleótidos, aminoácidos, tampón) no interfieran con las mediciones específicas del ensayo. P: ¿Puedo añadir una ARN polimerasa (RNAP) distinta de la ARNP T7 a mis reacciones de síntesis de proteínas de E. coli acelulares NEBExpress? R: No. El sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress fue diseñado específicamente para funcionar con la ARN polimerasa T7 proporcionada. Si el gen de interés está controlado por un promotor distinto al T7, se recomienda reemplazarlo con nuestro kit de mutagénesis dirigida Q5 (NEB n.° E0554S). P: ¿Puedo usar una concentración o formulación diferente de la ARN polimerasa T7 en mis reacciones de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress? R: No. El sistema de síntesis de proteínas de E. coli sin células NEBExpress fue diseñado específicamente para funcionar con la ARN polimerasa T7 proporcionada. P: El protocolo recomienda agitar vigorosamente las reacciones. ¿Es necesario? R: No es necesario agitar vigorosamente las reacciones si hay suficiente espacio libre en los tubos que las contienen. Agitar puede mejorar el rendimiento, pero no es obligatorio. Si decide agitar las reacciones, recomendamos hacerlo a 800-1000 rpm en un mezclador de temperatura controlada (por ejemplo, un Eppendorf ThermoMixer o equivalente). P: ¿Qué tamaño tiene el plásmido control DHFR-His de NEBExpress®? R: El plásmido control DHFR-His de NEBExpress® tiene 2775 pb. P: El protocolo recomienda agitar vigorosamente las reacciones. ¿Es esto obligatorio? R: Si hay suficiente espacio de cabeza en los tubos que contienen las reacciones, no es necesario agitar vigorosamente las reacciones. Agitar las reacciones puede ayudar a mejorar el rendimiento, pero no es obligatorio. Si decide agitarlas, recomendamos hacerlo a 800-1000 rpm en un mezclador con control de temperatura (por ejemplo, un Eppendorf ThermoMixer o equivalente).