Kit de clonación Gibson Assembly®, E5510S, New England Biolabs

La mezcla maestra Gibson Assembly ha sido reformulada con componentes que contienen albúmina recombinante (rAlbúmina) comenzando con el lote n.º 10229799. Categorías relacionadas Kits de ensamblaje de ADN, clonación y mutagénesis Aplicaciones Especificación de Gibson Assembly Materiales necesarios pero no suministrados Opciones de ADN polimerasa recomendadas para PCR ADN polimerasa de alta fidelidad Q5® (NEB n.º M0491) ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 Hot Start (NEB n.º M0493) Mezcla maestra 2X de alta fidelidad Q5 Hot Start (NEB n.º M0494) Placas LB (Luria-Bertani) con el antibiótico adecuado. Preguntas frecuentes P: No estoy seguro de si elegir NEBuilder HiFi DNA Assembly o NEB Gibson Assembly. ¿En qué se diferencian los productos? R: NEBuilder HiFi DNA Assembly ofrece varias ventajas sobre NEB Gibson Assembly. NEBuilder HiFi utiliza una polimerasa patentada de alta fidelidad, lo que resulta en un menor cribado/resecuenciación de constructos y un ensamblaje de alta fidelidad prácticamente sin errores. Esta característica también permite que NEBuilder se utilice en ciertas aplicaciones para las que NEB Gibson Assembly no es compatible: NEBuilder HiFi elimina los desajustes en los extremos 5' y 3' y puede utilizarse en rondas sucesivas de ensamblaje. Esto ahorra tiempo al evitar los largos pasos de amplificación por PCR. NEBuilder HiFi puede unir dos fragmentos ds con un oligonucleótido de ssADN sintético para una construcción simple y rápida (por ejemplo, inserción de enlazadores o biblioteca de ARNg). Para obtener información y datos más detallados, visite NEBuilderHifi.com. P: ¿Cuáles son las ventajas de este método en comparación con los métodos de clonación tradicionales? R: Gibson Assembly permite la inserción de uno o más fragmentos de ADN en prácticamente cualquier posición del vector linealizado y no depende de la presencia de sitios de restricción dentro de una secuencia específica para su síntesis o clonación. Por lo tanto, el usuario tiene control total sobre lo que se ensambla y se puede evitar la inserción de secuencias adicionales no deseadas, a menudo utilizadas para facilitar la manipulación de múltiples secuencias de ADN. Además, el método de ensamblaje de Gibson es rápido en comparación con la clonación estándar basada en enzimas de restricción. Finalmente, se puede unir un mayor número de fragmentos de ADN en una sola reacción con mayor eficiencia que los métodos convencionales. P: ¿Qué tamaño de fragmento de ADN puedo ensamblar? R: El kit de clonación de ensamblaje de Gibson se ha utilizado para clonar un fragmento de ADN de 15 kb en un plásmido de 5,4 kb en E. coli, con una longitud total de hasta 20,4 kb. Para productos ensamblados de más de 15 kb, NEB recomienda NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C3019) o NEB 10-beta Electrocompetent E. coli (NEB #C3020). P: ¿Cuántos fragmentos de ADN se pueden ensamblar en una reacción? R: El número de segmentos de ADN que se pueden ensamblar en una reacción depende de la longitud y la secuencia de los fragmentos. El método de ensamblaje Gibson se ha utilizado para ensamblar eficientemente hasta doce insertos de 0,4 kb en un vector a la vez. Sin embargo, recomendamos ensamblar cinco insertos o menos en un vector en una sola reacción para producir un clon con el inserto correcto. Si no es posible ensamblar todos los fragmentos en una sola reacción, se puede utilizar una estrategia de ensamblaje secuencial. Como alternativa, se puede considerar el método de ensamblaje Golden Gate para ensamblajes de más de 6 fragmentos. P: ¿Cuáles son los solapamientos más cortos que se pueden utilizar con este método de ensamblaje? R: Se ha logrado un ensamblaje productivo para fragmentos de ADN con un solapamiento de tan solo 12 pb; sin embargo, esto depende del contenido de GC del solapamiento. Recomendamos utilizar solapamientos de al menos 15 pb, o más, para el ensamblaje de dsADN con una Tm ≥ 48 °C (par AT = 2 °C y par GC = 4 °C). Aumentar la longitud de solapamiento entre fragmentos también reduce la cantidad de ADN necesaria para el ensamblaje. P: ¿Cuáles son los solapamientos más largos que se pueden utilizar con este método? R: La cantidad de exonucleasa 5' en la mezcla maestra de ensamblaje de Gibson y un tiempo de reacción de ensamblaje de 15 minutos se han optimizado para el ensamblaje de moléculas de ADN con solapamientos de ≤ 25 pb. Si el tiempo de reacción de ensamblaje se aumenta a 60 minutos, se pueden utilizar solapamientos de hasta 40 pb con el kit de clonación de ensamblaje de Gibson. P: ¿Se pueden ensamblar fragmentos de dsADN de ≤ 200 pb con este método? R: Sí. Para obtener resultados óptimos, utilice cada fragmento más pequeño con un exceso molar ≥ 5 veces mayor que el vector (inserto: vector 5:1) y mantenga la cantidad total de ADN en la reacción de Gibson entre 0,02 y 0,5 pmoles. P: ¿Se pueden combinar y ensamblar oligonucleótidos de ssADN con fragmentos de dsADN? R: Sí. Sin embargo, se debe determinar la concentración óptima de cada oligonucleótido. Como punto de partida, recomendamos usar 45 nM de cada oligonucleótido que sea menor o igual a doce oligonucleótidos de 60 bases que contengan solapamientos de 30 bases. P: ¿Funcionará la reacción a otras temperaturas? R: La reacción se ha optimizado a 50 °C, pero se ha demostrado que funciona entre 40 °C y 50 °C. P: ¿Es necesario purificar los productos de PCR al realizar ensamblajes de ADN con NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix o Gibson Assembly Master Mix? R: Generalmente, no es necesaria la purificación de los productos de PCR. Puede usar productos de PCR sin purificar directamente, siempre que el volumen total de productos de PCR sin purificar en la reacción de ensamblaje sea del 20 % o menos. Si se utilizan mayores cantidades de productos de PCR, recomendamos usar un kit de limpieza en columna (Monarch PCR & DNA Cleanup Kit, NEB n.° T1030). En caso de que se amplifiquen múltiples fragmentos o se observe la presencia de dímeros de cebadores, recomendamos optimizar el paso de PCR para obtener mejores resultados. P: ¿Es necesario inactivar las enzimas de restricción después de la digestión del vector? R: La inactivación de las endonucleasas de restricción generalmente no es necesaria, pero en algunos casos puede aumentar la eficiencia de la transformación. Si el inserto también contiene el sitio de restricción utilizado para linealizar el vector, es necesario inactivar la enzima de restricción por calor antes de mezclar el vector linealizado con el inserto en el ensamblaje Gibson. Si se utilizó una enzima de restricción resistente al calor para linealizar el vector, este debe purificarse mediante columnas de ADN, extracción con fenol-cloroformo o extracción en gel de agarosa después de la electroforesis, antes de entrar en contacto con el inserto. P: Me gustaría producir fragmentos de dsADN superpuestos mediante PCR. ¿Necesito utilizar cebadores de PCR purificados por PAGE o HPLC? R: No. Se pueden utilizar cebadores estándar desalinizados. P: ¿Puedo utilizar un solapamiento de 15 nt compuesto íntegramente por repeticiones de His-tag (es decir, CACCACCACCACCAC)? R: No, debe flanquear la secuencia de la etiqueta His a ambos lados con al menos 2 nucleótidos que no formen parte de la secuencia repetitiva de la etiqueta His. Como alternativa, intercale los codones his CAC y CAT para interrumpir esta secuencia repetitiva. Debe evitar las secuencias repetidas al final de un solapamiento. P: Me gustaría ensamblar oligonucleótidos de ADNmc en fragmentos de ADNdc. ¿Necesito usar oligonucleótidos purificados por PAGE o HPLC? R: No. Se pueden usar cebadores estándar desalinizados. Para obtener más información, descargue la nota de aplicación "Construcción de un vector de expresión sgRNA-Cas9 mediante puentes de oligonucleótidos de ADN monocatenario de fragmentos de ADN bicatenario". P: ¿Puedo amplificar por PCR el producto ensamblado? R: Sí. La molécula de ADN ensamblada está unida covalentemente y puede amplificarse por PCR. Además, si el producto final es una molécula de ADN circular cerrada, puede usarse como plantilla en la amplificación por círculo rodante (RCA). P: ¿Qué debo hacer si mi reacción de ensamblaje no produce colonias, solo unas pocas colonias o clones con un tamaño de inserto incorrecto tras la transformación en E. coli? R: Ensamble y transforme el control positivo proporcionado con la mezcla maestra de ensamblaje Gibson. El ensamblaje exitoso de un control positivo demostrará que la mezcla de ensamblaje es funcional y que las condiciones de transformación son adecuadas. Analice la reacción en un gel de agarosa. Una reacción de ensamblaje eficiente mostrará productos ensamblados del tamaño correcto y la desaparición de fragmentos. Revise el diseño del cebador de los fragmentos de ADN superpuestos para asegurar que haya suficiente superposición para facilitar el ensamblaje. Considere si el inserto clonado puede ser tóxico para E. coli y se debe utilizar un vector de bajo número de copias, como un BAC. Dado que el producto ensamblado es una molécula cerrada covalentemente, puede amplificarse alternativamente mediante PCR o RCA. Nuestras pruebas indican que la elección de células competentes es crucial. Recomendamos el uso de células químicamente competentes de alta eficiencia, como NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) (NEB n.° C2987). La reacción se puede añadir directamente a las células sin diluir, aunque una mayor dilución de la mezcla de reacción puede mejorar la eficiencia de la transformación. Sin embargo, al utilizar células químicamente competentes de alta eficiencia de otros proveedores, si no se obtienen colonias, recomendamos una dilución 1:4 de la reacción antes de la transformación. Para la transformación en todas las células electrocompetentes de alta eficiencia, incluidas las NEB, recomendamos una dilución 1:3 de la reacción. P: ¿Cómo puedo reducir el número de colonias de fondo solo de vector? R: Para reducir significativamente el fondo de colonias no deseadas solo de vector, el vector debe ser un producto de PCR en lugar de un fragmento de restricción. Si el fondo continúa siendo un problema, el vector amplificado por PCR se puede tratar con DpnI para eliminar el arrastre de plantilla, si corresponde, extraído de un gel de agarosa después de la electroforesis. P: ¿Qué tipo de células competentes son adecuadas para la transformación de construcciones de ADN creadas con Gibson Assembly? R: Las construcciones de ADN resultantes son compatibles con la mayoría de las células competentes de E. coli. NEB recomienda usar E. coli competente NEB 5-alfa (alta eficiencia, NEB n.° C2987). Si los productos ensamblados superan los 10 kb, NEB recomienda usar E. coli competente NEB 10-beta (alta eficiencia, NEB n.° C3019) o E. coli electrocompetente NEB 10-beta (NEB n.° C3020). Si los genes ensamblados contienen secuencias repetitivas, se debe usar E. coli competente estable NEB (NEB n.° C3040). P: ¿Puedo usar electroporación en lugar de transformación química? R: Sí, pero es necesario diluir el producto de la reacción de ensamblaje de Gibson al triple y usar solo 1 μl para la electroporación. Nota: Las células proporcionadas con este kit son químicamente competentes. P: ¿Existen diferencias entre la mezcla maestra de ensamblaje de Gibson (NEB n.° E2611) y la mezcla maestra de ensamblaje de Gibson incluida en el kit de clonación de ensamblaje de Gibson (NEB n.° E5510)? R: No, la mezcla maestra es la misma en ambos kits. El kit de clonación Gibson Assembly (NEB n.º E5510) incluye E. coli químicamente competente NEB 5-alfa. P: ¿Existen diferencias entre los requisitos para ensamblajes de 2-3 fragmentos frente a 4-6? R: Las principales diferencias entre ambos son la longitud de las secuencias superpuestas entre los fragmentos adyacentes y el tiempo de incubación de la reacción de ensamblaje. El protocolo de reacción de ensamblaje de 15 minutos se recomienda para el ensamblaje de 2-3 fragmentos flanqueados por superposiciones de 15-25 nt. El protocolo de ensamblaje de 1 hora se recomienda para el ensamblaje de hasta 6 fragmentos, flanqueados por superposiciones de 20-80 nt. La cantidad total de ADN en un ensamblaje de 4-6 fragmentos también es mayor que en un ensamblaje de 2-3 fragmentos. P: La reacción de control Gibson Assembly Master Mix no me está dando colonias. ¿Por qué? R: Nuestras pruebas indican que la elección de células competentes es fundamental. Recomendamos el uso de células químicamente competentes de alta eficiencia, como NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) (NEB #C2987). La reacción se puede agregar directamente a las células sin diluir, aunque una mayor dilución de la mezcla de reacción puede mejorar la eficiencia de la transformación. Sin embargo, al usar células químicamente competentes de alta eficiencia de otros proveedores, si no se obtuvieron colonias, recomendamos una dilución 1:4 de la reacción antes de la transformación. Para la transformación en todas las células electrocompetentes de alta eficiencia, incluidas las NEB, recomendamos una dilución 1:3 de la reacción. P: Al usar una polimerasa sin actividad exonucleasa 3'-5' (como la Taq ADN polimerasa) para amplificar fragmentos que se usarán en una reacción de ensamblaje de Gibson, ¿debería preocuparme por el posible desajuste 3' generado por la adición de un nucleótido sin plantilla? R: Este tipo de desajuste 3' puede afectar la eficiencia del ensamblaje, especialmente al intentar ensamblar un gran número de fragmentos (4-6). En esos casos, puede ser necesario cribar más colonias para obtener el clon correctamente ensamblado. Para evitarlo, recomendamos el uso de polimerasas que producen amplicones de extremos romos, como la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5. P: Cuando recibí mi kit de clonación Gibson Assembly, estaba almacenado a -80 °C. ¿Esto dañará la mezcla maestra Gibson Assembly? R: NEB recomienda almacenar la mezcla maestra Gibson Assembly a -20 °C al recibirla; sin embargo, la mezcla maestra es estable a -80 °C. Cuando utilice la mezcla maestra por primera vez, transfiérala a -20 °C para su posterior almacenamiento. Las células competentes incluidas en el kit de clonación deben almacenarse a -80 °C. No las almacene a -20 °C. P: Me gustaría usar NEBuilder, pero me preocupa la privacidad de los datos del usuario. ¿Cómo gestiona NEB la información que ingreso en NEBuilder? R: NEBuilder respeta la privacidad de los datos del usuario. En este punto, las secuencias del usuario no salen del navegador del cliente. Todo el procesamiento se realiza en el navegador del cliente. Se contacta con los servidores de NEB para: 1. Descargar la página y el código requerido al navegador; 2. Recuperar archivos de ayuda, manuales e imágenes; 3. Recuperar secuencias de vector o de inserción de muestra. No se transfieren datos del usuario del navegador a través del firewall a los servidores de NEB. Esto se puede verificar deshabilitando la conexión a internet del navegador después de que la página se haya cargado. Si bien no tendrá la comodidad de obtener secuencias de vector, el resto de la aplicación debería funcionar correctamente y producir los cebadores deseados. NEBuilder no es de código abierto en este momento ni está disponible en una versión de escritorio independiente. P: ¿Puedo usar otras herramientas de diseño de cebadores, como SnapGene para Gibson Assembly, para diseñar cebadores para NEBuilder HiFi DNA Assembly? R: Las reglas para diseñar cebadores son similares tanto para el ensamblaje Gibson como para el ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi. Cualquier cebador diseñado para el ensamblaje Gibson funcionará con NEBuilder HiFi. Sin embargo, algunos cebadores que funcionan con NEBuilder HiFi podrían no funcionar con Gibson, ya que, a diferencia de la mezcla maestra para ensamblaje Gibson, la mezcla maestra para ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi puede eliminar desajustes en el extremo 3'. Las herramientas que diseñan cebadores "Gibson" podrían no permitir el diseño de cebadores que aprovechen esta capacidad de NEBuilder HiFi. Si bien es posible utilizar otras herramientas, NEB recomienda nuestra herramienta gratuita, NEBuilder Assembly Tool, ya que permite diseñar cebadores que consideran los extremos del vector generados por la digestión con enzimas de restricción. P: ¿Qué resistencia a antibióticos se codifica en el control positivo de NEBuilder (control de ensamblaje)? R: El control positivo de NEBuilder es un inserto único en un plásmido pUC19 resistente a la ampicilina. Si su mezcla de ensamblaje funciona, obtendrá colonias en una placa de ampicilina utilizando el control positivo de NEBuilder.