New England Biolabs, E5520S, Kit de clonación de ensamblaje de ADN NEBuilder® HiFi

Categorías relacionadas con NEBuilder Síntesis de ARNsg, Ensamblaje de ADN, Kits de clonación y mutagénesis Aplicaciones Especificación del ensamblaje de ADN NEBuilder® HiFi Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Preguntas frecuentes P: ¿No estoy seguro de si elegir el ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi o el ensamblaje NEB Gibson? ¿En qué se diferencian los productos? R: El ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi ofrece varias ventajas sobre el ensamblaje NEB Gibson. NEBuilder HiFi utiliza una polimerasa patentada de mayor fidelidad, lo que resulta en un menor cribado/resecuenciación de constructos y un ensamblaje de alta fidelidad prácticamente sin errores. Esta característica también permite que NEBuilder se use en ciertas aplicaciones para las que no se puede usar el ensamblaje NEB Gibson: NEBuilder HiFi elimina los desajustes de los extremos 5' y 3', y se puede usar en rondas sucesivas de ensamblaje. Esto ahorra tiempo al evitar los largos pasos de amplificación por PCR. NEBuilder HiFi puede unir dos fragmentos ds con un oligonucleótido sintético de ssADN para una construcción simple y rápida (p. ej., inserción de enlazadores o biblioteca de ARNg). Para obtener información y datos más detallados, visite NEBuilderHifi.com. P: ¿Cuáles son las ventajas de este método en comparación con los métodos de clonación tradicionales? R: El ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi permite la inserción de uno o más fragmentos de ADN en prácticamente cualquier posición del vector linealizado y no depende de la presencia de sitios de restricción dentro de una secuencia específica. Por lo tanto, el usuario tiene control total sobre lo que se ensambla y se puede evitar la inserción de secuencias adicionales no deseadas, a menudo utilizadas para facilitar la manipulación de múltiples secuencias de ADN. Además, el método de ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi es rápido, en comparación con la clonación estándar basada en enzimas de restricción. Por último, se puede unir un mayor número de fragmentos de ADN en una sola reacción con mayor eficiencia que los métodos convencionales. P: ¿Existen diferencias entre la mezcla maestra de ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi y el kit de clonación de ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi? R: La mezcla maestra de ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi en ambos productos es la misma. El kit de clonación de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi incluye E. coli químicamente competente NEB 5-alfa adicional. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix/DNA Assembly Cloning Kit/Bundle for Large Fragments y el actual NEB Gibson Assembly Master Mix/Cloning Kit? R: El NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix utiliza una polimerasa de alta fidelidad con mayor precisión. Si bien los protocolos de estos kits son similares, los productos ensamblados de NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix y NEBuilder HiFi Cloning Kit suelen generar más colonias. Cuando se necesita ensamblar ADN grande (> 10 kb) o fragmentos múltiples (4+), aumentar la región de solapamiento a 30 pb mejora la eficiencia del ensamblaje y la transformación. Además, los productos NEBuilder no requieren el pago de licencias por parte de NEB. P: ¿Cuál es el fragmento individual más grande que se ha ensamblado con NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix? R: La mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi se ha utilizado para clonar un constructo de 22,7 kb de longitud. Para productos ensamblados de más de 15 kb, NEB recomienda NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency, NEB n.° C3019), incluido en el paquete NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle para fragmentos grandes (NEB n.° E2623). Como alternativa, puede utilizar NEB 10-beta Electrocompetent E. coli (NEB n.° C3020). P: ¿Cuántos fragmentos de ADN se pueden ensamblar en una reacción? R: El número de segmentos de ADN que se pueden ensamblar en una reacción depende de la longitud y la secuencia de los fragmentos. La mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi se ha utilizado para ensamblar eficientemente hasta once insertos de 0,4 kb en un vector a la vez. Sin embargo, recomendamos ensamblar cinco insertos o menos en un vector en una reacción para producir un clon con el inserto correcto. Se puede utilizar una estrategia de ensamblaje secuencial si no es posible ensamblar todos los fragmentos en una sola reacción. Como alternativa, considere el ensamblaje Golden Gate para ensamblajes de más de 6 fragmentos. P: ¿Es este método aplicable al ensamblaje de secuencias repetitivas? R: Sí. Sin embargo, es necesario asegurarse de que cada fragmento de ADN incluya una superposición única para que las secuencias puedan hibridar y organizarse correctamente. La secuencia repetitiva también puede internalizarse en la primera etapa de una estrategia de ensamblaje en dos etapas. Si es inevitable tener secuencias repetitivas en los extremos de cada fragmento, se puede producir el ensamblaje de ADN correcto, aunque con menor eficiencia que otros ensamblajes no deseados. Como alternativa, considere el ensamblaje Golden Gate para ensamblajes que contienen secuencias repetitivas. P: ¿Cuáles son las superposiciones más cortas que se pueden utilizar con este método de ensamblaje? R: Se ha logrado un ensamblaje productivo para fragmentos de ADN con una superposición de tan solo 12 pb; sin embargo, depende del contenido de GC de la superposición. Recomendamos usar solapamientos de al menos 15 pb, o más, para el ensamblaje de dsADN con una Tm ≥ 48 °C (par AT = 2 °C y par GC = 4 °C). Aumentar la longitud del solapamiento entre fragmentos también reduce la cantidad de ADN necesaria para el ensamblaje. P: ¿Cuáles son los solapamientos más largos que se pueden usar con este método? R: Tanto la cantidad de exonucleasa 5' en la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi como el tiempo de reacción de ensamblaje de 15 minutos se han optimizado para el ensamblaje de moléculas de ADN con solapamientos ≤ 20 pb. Si el tiempo de reacción de ensamblaje se aumenta a 60 minutos, se pueden usar solapamientos de hasta 30 pb con la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi. P: ¿Se pueden ensamblar fragmentos de dsADN ≤ 200 pb con este método? R: Sí. Para obtener resultados óptimos, use estos fragmentos en un exceso ≥ 5 veces mayor. P: ¿Se pueden ensamblar múltiples oligonucleótidos de ssADN con fragmentos de dsADN? R: Sí. Sin embargo, se debe determinar la concentración óptima de cada oligonucleótido. Como punto de partida, recomendamos usar 45 nM de cada oligonucleótido que sea menor o igual a doce oligonucleótidos de 60 bases con solapamientos de 30 bases. Para más información, descargue la nota de aplicación "Construcción de un vector de expresión sgRNA-Cas9 mediante puentes de oligonucleótidos de ADN monocatenario con fragmentos de ADN bicatenario". P: ¿Se pueden usar tiempos de incubación más largos o más cortos? R: Sí. Para ensamblar de 2 a 3 fragmentos, son suficientes tiempos de incubación de 15 minutos. Para ensamblar de 4 a 6 fragmentos, se recomiendan tiempos de incubación de 60 minutos. Generalmente, no se recomiendan tiempos de reacción inferiores a 15 minutos. Se ha demostrado que tiempos de incubación prolongados (hasta 4 horas) mejoran la eficiencia del ensamblaje en algunos casos. No incube la reacción durante la noche. P: ¿Funcionará la reacción a otras temperaturas? R: La reacción se ha optimizado a 50 °C, pero se ha demostrado que funciona entre 40 °C y 50 °C. P: ¿Es necesario purificar los productos de PCR al realizar ensamblajes de ADN utilizando NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix o Gibson Assembly Master Mix? R: La purificación de los productos de PCR generalmente no es necesaria. Puede utilizar productos de PCR sin purificar directamente, siempre que el volumen total de productos de PCR sin purificar en la reacción de ensamblaje sea del 20 % o menos. Si se utilizan mayores cantidades de productos de PCR, recomendamos el uso de un kit de limpieza basado en columna (Monarch PCR & DNA Cleanup Kit, NEB n.º T1030). En caso de que se amplifiquen múltiples fragmentos o se observe la presencia de dímeros de cebadores, recomendamos optimizar el paso de PCR para obtener mejores resultados. P: ¿Es necesario inactivar las enzimas de restricción después de la digestión del vector? R: La inactivación de las endonucleasas de restricción generalmente no es necesaria, pero en algunos casos podría aumentar la eficiencia de la transformación. Si el inserto y el producto ensamblado final también llevan el sitio de restricción que se usó para linealizar el vector, es necesario inactivar por calor la enzima de restricción o purificar el vector cortado si la inactivación por calor no es posible. P: Me gustaría producir fragmentos de dsADN superpuestos por PCR. ¿Necesito usar cebadores de PCR que hayan sido purificados por PAGE o HPLC? R: No. Se pueden usar cebadores estándar desalados. P: Me gustaría ensamblar oligonucleótidos de ssADN en fragmentos de dsADN. ¿Necesito usar oligonucleótidos que hayan sido purificados por PAGE o HPLC? R: No. Se pueden usar cebadores estándar desalados. Para obtener más información, descargue la nota de aplicación, Construcción de un vector de expresión sgRNA-Cas9 mediante puentes de oligonucleótidos de ADN monocatenario de fragmentos de ADN bicatenario. P: ¿Puedo usar un solapamiento de 15 nt que esté compuesto completamente de repeticiones de etiqueta His (es decir, CACCACCACCACCAC)? R: No, debe flanquear la secuencia de la etiqueta His a ambos lados con al menos 2 nucleótidos que no formen parte de la secuencia repetitiva de la etiqueta His. Alternativamente, intercale los codones his CAC y CAT para interrumpir esta secuencia repetitiva. Debe evitar repetir secuencias al final de un solapamiento. P: ¿Puedo amplificar por PCR el producto ensamblado? R: Sí. La molécula de ADN ensamblada está unida covalentemente y puede amplificarse por PCR. Además, si el producto final es una molécula de ADN circular cerrada, puede usarse como plantilla en la amplificación por círculo rodante (RCA). P: La reacción de control positivo NEBuilder no genera colonias. ¿Por qué? R: Nuestras pruebas indican que la elección de células competentes es crucial. Recomendamos el uso de células químicamente competentes de alta eficiencia, como NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) (NEB #C2987). Transforme las células competentes con el control de ADN pUC19 para confirmar que las células son viables. P: ¿Qué debo hacer si mi reacción de ensamblaje no produce colonias, solo unas pocas colonias o clones con un tamaño de inserto incorrecto tras la transformación en E. coli? R: Ensamble y transforme el control positivo proporcionado con el kit de clonación/mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi. El ensamblaje exitoso de un control positivo demostrará que la mezcla de ensamblaje es funcional y que las condiciones de transformación son adecuadas. Analice la reacción en un gel de agarosa. Una reacción de ensamblaje eficiente mostrará productos ensamblados del tamaño correcto y la desaparición de fragmentos. Compruebe el diseño del cebador de los fragmentos de ADN superpuestos para asegurar que haya suficiente superposición para facilitar el ensamblaje. Considere si el inserto clonado puede ser tóxico para E. coli y se debe utilizar un vector de bajo número de copias, como un BAC. P: ¿Cómo puedo reducir el número de colonias de fondo solo con vector? R: Para reducir significativamente el fondo de colonias no deseadas solo con vector, el vector debe ser un producto de PCR en lugar de un fragmento de restricción. Si el fondo persiste, el vector amplificado por PCR puede tratarse con DpnI para eliminar el arrastre de la plantilla, si procede, extraído de un gel de agarosa tras la electroforesis. P: ¿Qué tipo de células competentes son adecuadas para la transformación de las construcciones de ADN creadas con la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi? R: Las construcciones de ADN resultantes son compatibles con la mayoría de las células competentes de E. coli. NEB recomienda utilizar NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C2987). Si los productos ensamblados superan los 15 kb, NEB recomienda utilizar NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C3019) o NEB 10-beta Electrocompetent E. coli (NEB #C3020). Si los genes ensamblados contienen secuencias repetitivas, se debe utilizar NEB Stable Competent E. coli (NEB #C3040). ¿No está seguro de qué cepa de clonación elegir? El muestreador NEB Cloning Competent E. coli (NEB n.° C1010) le permite muestrear 4 de nuestras populares cepas químicamente competentes. P: ¿Puedo usar electroporación en lugar de transformación química? R: Sí, pero es necesario diluir el producto de la reacción de ensamblaje de Gibson al triple y usar solo 1 μl para la electroporación. Nota: Las células proporcionadas con este kit son químicamente competentes. P: ¿Existen diferencias entre los requisitos para ensamblajes de 2 a 3 fragmentos y de 4 o más? R: Las principales diferencias entre ambos son la longitud de las secuencias superpuestas entre los fragmentos adyacentes y el tiempo de incubación de la reacción de ensamblaje. El protocolo de reacción de ensamblaje de 15 minutos se recomienda para el ensamblaje de 2 a 3 fragmentos flanqueados por solapamientos de 15 a 20 nt. El protocolo de ensamblaje de 1 hora se recomienda para el ensamblaje de 4 o más fragmentos flanqueados por solapamientos de 20 a 30 nt. P: ¿Puedo usar el producto de PCR amplificado a partir de la ADN polimerasa Taq? R: Sí. La base A adicional en el extremo 3' del producto de PCR se eliminará durante el ensamblaje del ADN si se convierte en un residuo desapareado una vez que los fragmentos se hibridan. P: ¿Puedo usar otras herramientas de diseño de cebadores, como SnapGene para Gibson Assembly, para diseñar cebadores para NEBuilder HiFi DNA Assembly? R: Las reglas para diseñar cebadores son similares tanto para Gibson Assembly como para NEBuilder HiFi DNA Assembly. Cualquier cebador diseñado para Gibson Assembly funcionará con NEBuilder HiFi. Sin embargo, algunos cebadores que funcionan con NEBuilder HiFi podrían no funcionar con Gibson porque, a diferencia de Gibson Assembly Master Mix, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix puede eliminar desapareamientos en el extremo 3'. Es posible que las herramientas que diseñan cebadores "Gibson" no permitan el diseño de cebadores que aprovechen esta capacidad de NEBuilder HiFi. Si bien es posible usar otras herramientas, NEB recomienda usar nuestra herramienta gratuita, NEBuilder Assembly Tool, ya que permite diseñar cebadores que consideran los extremos del vector generados por la digestión con enzimas de restricción. P: ¿Tiene alguna sugerencia sobre cómo mejorar el ensamblaje del ADN al usar ADN sintetizado (p. ej., gBlocks) y NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (E2621/E5520/E2623)? R: Introducir un paso de amplificación en el flujo de trabajo puede producir mejores resultados. La amplificación de los gBlocks usando una polimerasa de alta fidelidad como Q5 (M0491S) como primer paso en el flujo de trabajo de ensamblaje puede aumentar la cantidad de ADN disponible para el ensamblaje y, en consecuencia, el número de plásmidos correctamente ensamblados. P: Quiero unir dos fragmentos, pero la secuencia de solapamiento está a 500 pb del final del vector. ¿Puede NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix lograr esto? R: NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix se puede usar para unir un fragmento de ADN a 20 pb del final del vector. Para unir un fragmento a una mayor distancia del final, complemente la mezcla maestra con 0,1-0,3 unidades de exonucleasa T5. Diluya la exonucleasa T5 (M0663, 10 unidades/ul) en tampón rCutSmart 1X. A continuación, añada la enzima diluida a la reacción de ensamblaje junto con la mezcla maestra de ADN 2X. Incube a 50 °C durante 1 hora y luego transforme en células competentes de alta eficiencia, como NEB 5-alfa o NEB 10-beta. La exonucleasa T5 debe diluirse inmediatamente antes de su uso y no puede almacenarse en tampón rCutSmart 1X. P: ¿Cómo puedo mejorar la eficiencia de las reacciones de ensamblaje muy complejas al utilizar la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi? R: Una reacción de ensamblaje muy compleja puede contener 6 o más fragmentos de ADN, incluidos los productos de digestión con enzimas de restricción sin purificar. Por ejemplo, puede que esté utilizando un inserto que se ha cortado de un plásmido pero no se ha purificado, de modo que hay dos fragmentos de ADN: el inserto y el vector original. Solo el fragmento del inserto se ensamblará con otros fragmentos. La eficiencia de estas complejas reacciones de ensamblaje se puede aumentar incubando las reacciones a 45 °C en lugar de 50 °C. Recomendamos usar 0,05 pmol de cada plásmido digerido, con un máximo de 0,5 pmol de ADN en la reacción. P: ¿Cómo se deben preparar los fragmentos para el ensamblaje con NEBuilder HiFi? R: Los fragmentos se pueden preparar mediante los siguientes métodos: Los fragmentos generados por PCR se pueden limpiar utilizando la columna Monarch PCR o el kit Exo-CIP Rapid PCR Cleanup si la pureza del amplicón es superior al 95 %. Si se utilizó ADN plasmídico como plantilla durante la PCR, se puede eliminar mediante tratamiento con DpnI si es necesario. Si se observan múltiples bandas, recomendamos optimizar la PCR. Si esto no es posible, se recomienda la purificación en gel. La extracción en gel puede introducir tiocianato de guanidina (del tampón de disolución), lo que puede reducir la eficiencia de la reacción de ensamblaje. Para minimizar esta contaminación, recorte el corte de gel para que se pueda utilizar una menor cantidad de tampón de disolución. La digestión de un plásmido con enzimas de restricción se puede realizar seguida de inactivación por calor o purificación en columna. Los fragmentos ordenados comercialmente se pueden resuspender en agua libre de nucleasas o tampón TE y usarse directamente en la reacción de ensamblaje. P: Me gustaría miniaturizar el ensamblaje de ADN con NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix utilizando el manipulador de líquidos Labcyte Echo. ¿Tiene alguna información que pueda consultar para ayudarme a automatizar el ensamblaje de ADN? R: Las siguientes referencias de Labcyte están disponibles: Nota de aplicación: Ensamblaje de ADN multipieza miniaturizado Nota técnica: Ensamblaje de ADN modular de PIK3CA mediante transferencia acústica de líquido en volúmenes de nanolitros Nota técnica: Ensamblaje de ADN a escala de nanolitros utilizando el kit de clonación NEBuilder HiFi P: ¿Cómo afecta la longitud de superposición a la eficiencia del ensamblaje de ADN de NEBuilder HiFi? R: Las superposiciones más largas (20-30 pares de bases) aumentan la eficiencia del ensamblaje. Se ensamblaron cuatro fragmentos (~20 fmol) con una superposición de 15 o 20 pb utilizando la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi (NEB n.° E2621) a 50 °C durante 60 minutos para crear un vector pUC19. 2 µl de la mezcla ensamblada se transformaron en E. coli competente NEB 5-alfa (NEB n.° C2987) y se extendieron en una placa LB/Amp que contenía IPTG y X-gal. Se contaron las colonias azules que indicaron un ensamblaje correcto. La mezcla de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi es más eficiente utilizando una superposición de 20 pb en comparación con una superposición de 15 pb. P: ¿Qué resistencia a los antibióticos está codificada en el control positivo NEBuilder (control de ensamblaje)? R: El control positivo NEBuilder es un inserto único en un plásmido pUC19 que es resistente a la ampicilina. Si su mezcla de ensamblaje funciona, obtendrá colonias en una placa de ampicilina utilizando el control positivo NEBuilder.