New England Biolabs, E6320S, Kit de secuenciación inmunitaria NEBNext® (humano)

El tamaño grande de este producto se discontinuó el 15 de diciembre de 2025. El tamaño pequeño seguirá estando disponible. Categorías relacionadas Secuenciación de influenza,, Secuenciación de próxima generación Preguntas frecuentes sobre la preparación de bibliotecas P: ¿Qué tipo de muestras se pueden usar con el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (humano) (NEB n.º E6320)? R: Se puede usar ARN de diversas fuentes con el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (humano), que incluye: ARN de alta calidad de células B o T. El ARN debe tener una puntuación RIN ≥7 para proporcionar el mayor porcentaje de transcripciones de longitud completa para la construcción de la biblioteca. Cuando se usa ARN con puntuaciones RIN <4, la complejidad de la biblioteca se reduce considerablemente. ARN de cualquier muestra humana que contenga células B o T, como PBMC de sangre periférica o tejido. ARN extraído de pellets de células congeladas, células cultivadas o células clasificadas para tipos específicos de células B o T. P: ¿Funcionará el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (humana) (NEB n.° E6320) con especies no humanas? R: No, este kit no incluye cebadores no humanos (p. ej., de ratón). Para cebadores de ratón, consulte el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón) (NEB n.° E6330). P: ¿Puedo usar tejido FFPE con el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (humana) (NEB n.° E6320)? R: Es improbable que el ARN derivado de tejido FFPE tenga la calidad suficiente para generar bibliotecas de secuenciación inmunitaria de alta calidad. P: ¿Qué tipo de método de extracción de ARN debo usar antes del kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (humana) (NEB n.° E6320)? R: Los protocolos de extracción de ARN más comunes deberían ser suficientes; sin embargo, recomendamos el kit Monarch® Total RNA Miniprep (NEB n.° T2010). P: ¿Qué parámetros de secuenciación se deben utilizar con estas bibliotecas? R: La secuenciación se debe realizar en un Illumina® MiSeq™, utilizando la química de secuenciación Illumina V3. Recomendamos ejecutar 300 pb x 300 pb, si es posible (utilizando un kit de reactivos V3 MiSeq de 600 ciclos), con la lectura del índice entre la primera y la segunda lectura. P: ¿Qué profundidad de secuenciación se requiere para las bibliotecas de secuenciación inmunitaria? R: La profundidad de secuenciación requerida depende en gran medida de las preguntas biológicas que se intentan responder. Normalmente, 500.000 lecturas por biblioteca es un buen punto de partida para la mayoría de los proyectos para saturar una detección de 3000-4000 clonotipos. Si la diversidad del repertorio inmunitario de la muestra de ARN es mayor, se necesitan más lecturas de secuenciación para detectar todos los clonotipos de baja frecuencia. P: ¿Qué códigos de barras se deben secuenciar juntos? R: Los códigos de barras que se incluyen en el kit forman parte de NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers Set 1, NEB n.º E7600). Puede consultar el manual del producto para elegir los códigos de barras para la agrupación de bibliotecas. P: ¿Cómo analizo los datos generados a partir de bibliotecas de secuenciación inmunitaria? R: Existen varias herramientas disponibles públicamente para realizar análisis de datos. Recomendamos utilizar el kit de herramientas pRESTO, compatible con los datos del NEBNext® Immune Sequencing Kit, incluida la deconvolución del identificador molecular único (UMI). Hemos implementado el pipeline pRESTO en Galaxy para uso público. Visite este enlace para acceder al pipeline y consulte nuestro tutorial si es nuevo en la plataforma Galaxy. P: No tengo una máquina de qPCR. ¿Puedo seguir utilizando el NEBNext Immune Sequencing Kit (Human) (NEB n.º E6320)? R: El paso de qPCR es opcional; solo se utiliza para identificar las condiciones óptimas finales de ciclado de PCR, ya que cada muestra puede contener cantidades variables de moléculas amplificables. Se puede lograr un resultado similar tomando manualmente una alícuota de la reacción de PCR cada 5 ciclos y visualizando cada alícuota diluyéndola 5 veces y cargándola en un Agilent Bioanalyzer® o TapeStation™ para identificar el número óptimo de ciclado que produce el producto más alto con el fondo y la sobreamplificación más bajos. Típicamente, la mayoría de las muestras amplificarán mejor en el rango de 6 a 18 ciclos, dependiendo de la entrada de ARN. P: ¿Necesito realizar el paso de qPCR cada vez? R: Es mejor realizar el paso de qPCR cada vez que se usa una nueva muestra de ARN y/o se prepara un nuevo tipo de biblioteca (por ejemplo, receptor de células B vs. receptor de células T vs. ambos). Al preparar una biblioteca replicada, se puede usar el mismo número de ciclo de PCR que en la preparación original. P: ¿Necesito extraer en gel mi biblioteca final? R: Hemos encontrado que la extracción en gel es innecesaria para la mayoría de las bibliotecas. Una limpieza con microesferas SPRI o AMPure® suele ser suficiente al final. P: ¿Qué cebadores específicos para genes de linfocitos B y T se incluyen en el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (humano) (NEB n.° E6320)? ¿Cuál es el formato de los cebadores? R: El kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (humano) incluye cebadores para la cadena pesada y la cadena ligera de linfocitos B (IGH/K/L), y cebadores para la cadena alfa y la cadena beta de linfocitos T (TRA/B). Los cebadores incluidos en este kit se suministran en dos tubos. Un tubo contiene cebadores para la cadena pesada y la cadena ligera de linfocitos B (IGH/K/L). El otro tubo contiene cebadores para la cadena alfa y la cadena beta de linfocitos T (TRA/B). P: ¿El kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (humano) (NEB n.° E6320) funciona con ADN? R: Este kit está optimizado para ARN diana únicamente. Puede haber ADN presente en la muestra, pero los cebadores incluidos en el kit no lo amplificarán. P: ¿El kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (humano) (NEB n.° E6320) proporcionará información sobre el emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras? R: No, este kit utiliza ARN total extraído de la muestra deseada; por lo tanto, se perderá la información de cada célula sobre el emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras.