New England Biolabs, E6330S, Kit de secuenciación inmunitaria NEBNext® (ratón)

El tamaño grande de este producto se discontinuó el 15 de diciembre de 2025. El tamaño pequeño seguirá estando disponible. Categorías relacionadas Secuenciación de influenza,, Secuenciación de próxima generación Preguntas frecuentes sobre la preparación de bibliotecas P: ¿Qué tipo de muestras se pueden usar con el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón) (NEB n.º E6330)? R: Se puede usar ARN de diversas fuentes con el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón), que incluye: ARN de alta calidad de células B o T. El ARN debe tener una puntuación RIN ≥7 para proporcionar el mayor porcentaje de transcripciones de longitud completa para la construcción de la biblioteca. Cuando se usa ARN con puntuaciones RIN <4, la complejidad de la biblioteca se reduce considerablemente. ARN de cualquier muestra de ratón que contenga células B o T, como PBMC de sangre periférica o tejido. ARN extraído de pellets de células congeladas, células cultivadas o células clasificadas para tipos específicos de células B o T. P: ¿Funcionará el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón) (NEB n.° E6330) con especies distintas de la murina? R: No, el kit para ratones no incluye cebadores para especies distintas de la murina (p. ej., humanos). Para cebadores humanos, consulte el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (humano) (NEB n.° E6320). P: ¿Puedo usar tejido FFPE con el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón) (NEB n.° E6330)? R: Es improbable que el ARN derivado de tejido FFPE tenga la calidad suficiente para generar bibliotecas de secuenciación inmunitaria de alta calidad. P: ¿Qué tipo de método de extracción de ARN debo usar antes del kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón) (NEB n.° E6330)? R: Los protocolos de extracción de ARN más comunes deberían ser suficientes; sin embargo, recomendamos el kit Monarch® Total RNA Miniprep (NEB n.° T2010). P: ¿Qué parámetros de secuenciación se deben utilizar con estas bibliotecas? R: La secuenciación se debe realizar en un Illumina® MiSeq™, utilizando la química de secuenciación Illumina V3. Recomendamos ejecutar 300 pb x 300 pb, si es posible (utilizando un kit de reactivos V3 MiSeq de 600 ciclos), con la lectura del índice entre la primera y la segunda lectura. P: ¿Qué profundidad de secuenciación se requiere para las bibliotecas de secuenciación inmunitaria? R: La profundidad de secuenciación requerida depende en gran medida de las preguntas biológicas que se intentan responder. Normalmente, 500.000 lecturas por biblioteca es un buen punto de partida para la mayoría de los proyectos para saturar una detección de 3000-4000 clonotipos. Si la diversidad del repertorio inmunitario de la muestra de ARN es mayor, se necesitan más lecturas de secuenciación para detectar todos los clonotipos de baja frecuencia. P: ¿Qué códigos de barras se deben secuenciar juntos? R: Los códigos de barras incluidos en el kit forman parte de NEBNext® Multiplex Oligos para Illumina® (Set 1 de Cebadores de Doble Índice, NEB n.° E7600). Puede consultar el manual del producto para seleccionar los códigos de barras para la agrupación de bibliotecas. P: No tengo un equipo de qPCR, ¿puedo usar el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón) (NEB n.° E6330)? R: El paso de qPCR es opcional; solo se utiliza para identificar las condiciones óptimas para el ciclado final de la PCR, ya que cada muestra puede contener cantidades variables de moléculas amplificables. Se puede obtener un resultado similar tomando manualmente una alícuota de la reacción de PCR cada 5 ciclos y visualizando cada alícuota diluyéndola 5 veces y cargándola en un Agilent Bioanalyzer® o TapeStation™ para identificar el número óptimo de ciclado que produce el mayor producto con el menor ruido de fondo y sobreamplificación. Normalmente, la mayoría de las muestras se amplifican mejor en un rango de 6 a 18 ciclos, dependiendo del ARN de entrada. P: ¿Cómo analizo los datos generados a partir de bibliotecas de secuenciación inmunitaria? R: Existen varias herramientas disponibles públicamente para realizar análisis de datos. Recomendamos usar el kit de herramientas pRESTO, compatible con los datos del kit de secuenciación inmunitaria NEBNext®, incluyendo la deconvolución del identificador molecular único (UMI). Hemos implementado el proceso de pRESTO en Galaxy para uso público. Visite este enlace para ver el proceso y consulte nuestro tutorial si es nuevo en la plataforma Galaxy. P: ¿Necesito realizar la qPCR cada vez? R: Es mejor realizar la qPCR cada vez que se utiliza una nueva muestra de ARN o se prepara un nuevo tipo de biblioteca (por ejemplo, receptor de células B vs. receptor de células T vs. ambos). Al preparar una biblioteca replicada, se puede usar el mismo número de ciclo de PCR que en la preparación original. P: ¿Necesito extraer en gel mi biblioteca final? R: Hemos comprobado que la extracción en gel no es necesaria para la mayoría de las bibliotecas. Una limpieza con microesferas SPRI o AMPure® suele ser suficiente al final. P: ¿Qué cebadores específicos para genes de linfocitos B y T se incluyen en el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón) (NEB n.° E6330)? ¿Cuál es el formato de los cebadores? R: El kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón) incluye cebadores para las cadenas pesada y ligera de linfocitos B (IGH/K/L), y cebadores para las cadenas alfa, beta, gamma y delta de linfocitos T (TRA/B/G/D). Los cebadores incluidos en este kit se suministran en dos tubos. Un tubo contiene cebadores para las cadenas pesada y ligera de linfocitos B (IGH/K/L). El otro tubo contiene cebadores para las cadenas alfa y beta de linfocitos T (TRA/B). P: ¿Funciona el kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón) (NEB n.° E6330) con ADN? R: Este kit está optimizado para ARN. Si bien la muestra puede contener ADN, los cebadores incluidos no lo amplificarán. P: ¿El kit de secuenciación inmunitaria NEBNext (ratón) (NEB n.° E6330) proporcionará información sobre el emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras? R: No, este kit utiliza ARN total extraído de la muestra deseada; por lo tanto, se perderá la información de cada célula sobre el emparejamiento de cadenas pesadas y ligeras.