New England Biolabs, E6420L, Kit de preparación de biblioteca de ARN de células individuales/bajo aporte NEBNext® para Illumina®

Categorías relacionadas con NEBNext Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina, Especificación de preparación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación Materiales necesarios pero no suministrados Etanol al 80 % (recién preparado) Agua sin nucleasas Tubos DNA LoBind (Eppendorf® n.º 022431021) Gradilla o placa magnética (p. ej., Gradilla de separación magnética NEBNext® (NEB n.º S1515S), placa supermagnética Alpaqua ® 96S (n.º A001322) o equivalente) Termociclador Microcentrífuga Vortex Kit de reactivos SPRIselect (Beckman Coulter®, Inc. n.º B23317) o perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63881) Agilent® Bioanalyzer® o analizador de fragmentos similar y consumibles asociados Oligos DNasa NEBNext Tubos de tiras para PCR sin ARNasa (USA Scientific 1402-1708) Preguntas frecuentes P: ¿Cuánto cuesta ¿Se puede transferir PBS de la recolección de células al protocolo de síntesis y amplificación de ADNc? R: Para obtener resultados óptimos, el arrastre de PBS debe limitarse a ≤5 µl. No se recomiendan volúmenes de arrastre mayores, ya que comprometerán el rendimiento y la calidad de los datos. P: ¿Qué tipos de células admite el kit de preparación de biblioteca de ARN de célula única/bajo aporte NEBNext®? R: El kit está optimizado para su uso con una variedad de tipos de células eucariotas. Sin embargo, la lisis celular no es compatible con células fijas o células con paredes celulares (p. ej., células vegetales y fúngicas). Si se extrae ARN de buena calidad de estas muestras, se puede seguir el Capítulo 2 para ARN de bajo aporte para la síntesis, amplificación y generación de bibliotecas de ADNc. El kit no es compatible con ARNm sin colas de poli(A) (p. ej., de células bacterianas). P: ¿Puedo resuspender las células en tampones/medios que no sean PBS antes de la recolección de células? R: Recomendamos encarecidamente que las células se resuspendan en tampón PBS antes de la recolección de células. Si el PBS solo no es una opción viable, las células pueden resuspenderse en PBS suplementado con BSA. Se pueden incluir hasta 0,5 ng de BSA en la reacción de síntesis y amplificación de ADNc. Si las células se resuspenden en un medio de cultivo celular, por ejemplo, DMEM con 10 % de FBS, el volumen de arrastre durante la recolección celular debe ser mínimo (10-15 nl). Para las células clasificadas, no utilice más de 5 µl de volumen de arrastre. Consulte estas preguntas frecuentes. P: ¿Es necesario clasificar las células en un reactivo específico? R: Recomendamos clasificar las células en tampón de lisis celular 1X, según las instrucciones del manual. P: ¿Se pueden utilizar células congeladas? R: Sí. Las células pueden clasificarse en tampón de lisis celular 1X, congelarse instantáneamente y almacenarse a -80 °C. Si, en cambio, las células se recogen en PBS o agua antes de congelarlas, prepare el tampón de lisis celular 1X según la sección 1.2 (Recolección y lisis celular) de los manuales suministrados con el kit de preparación de biblioteca de ARN de células individuales/bajo consumo NEBNext (NEB n.° E6420) o el módulo de síntesis y amplificación de ADNc de células individuales/bajo consumo NEBNext (NEB n.° E6421), teniendo en cuenta el volumen de almacenamiento de las células. P: ¿Se pueden lisar las células con otros tampones de lisis celular? R: No recomendamos lisar las células con tampones de lisis celular distintos del tampón suministrado. El kit es incompatible con tampones de lisis celular que contengan sales de guanidio o detergentes desnaturalizantes, como el SDS. P: ¿Cuánto tiempo se puede almacenar el ADNc sintetizado (antes de su amplificación) antes de la amplificación? R: El ADNc (antes de su amplificación) puede almacenarse de forma segura durante la noche a 4 °C o -20 °C. Si la muestra debe almacenarse durante más tiempo, añada 0,5 µl de tampón de lisis celular NEBNext 10X al ADNc (después de la RT en lugar de durante la PCR). Las muestras pueden almacenarse a -20 °C hasta 7 días, pero podría observarse una ligera disminución en el rendimiento. P: ¿Qué tipos de ARN son compatibles? R: El ADNc se sintetiza selectivamente directamente a partir de ARN con cola de poli(A), y el cambio de molde durante la transcripción inversa es más eficiente a partir de ARN molde con una estructura de capuchón 5'. Por lo tanto, el kit funciona de forma más eficiente con muestras de ARN con un número de integridad del ARN (RIN) alto ≥8. El kit no es adecuado para muestras de ARN FFPE altamente fragmentadas. P: ¿Es necesario purificar el ARN total de entrada? R: La muestra de ARN debe estar libre de sales (p. ej., Mg2+ o sales de guanidinio), agentes quelantes de cationes divalentes (p. ej., EDTA, EGTA, citrato) o compuestos orgánicos (p. ej., fenol y etanol). Si hay una cantidad excesiva de ADN genómico en las muestras de ARN, se puede realizar un tratamiento opcional con DNasa I. La DNasa I debe inactivarse o eliminarse después del tratamiento. P: Mi muestra de ARN total tiene un volumen > 8 µl. ¿Puedo seguir usando el kit? R: Sí. Para ARN total en agua o con baja TE, puede usar hasta 11 µl eliminando la adición de agua en la Sección 2.3 (Transcripción inversa y cambio de molde). Para células clasificadas, no use más de 5 µl de volumen de arrastre. Consulte estas preguntas frecuentes. P: ¿Son intercambiables las dos mezclas maestras de PCR del kit? R: No. La mezcla maestra NEBNext Single Cell cDNA PCR debe usarse para amplificar el ADNc después de la reacción de RT, mientras que la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 debe usarse para amplificar las bibliotecas finales para la secuenciación de Illumina®. P: Para una entrada baja de ADNc, ¿tengo que hacer una limpieza de doble perla después de la PCR final? R: Para una entrada baja de ADNc (100-200 pg), puede ser necesario realizar una limpieza de doble perla para eliminar el exceso de dímeros adaptadores. Para determinar la pureza de la biblioteca, analice las bibliotecas en un chip DNA High Sensitivity Bioanalyzer® o un instrumento similar. P: ¿Cuánta entrada de ADNc puedo usar para la preparación de la biblioteca de ADN NEBNext Ultra II FS? R: 100 pg–20 ng de ADNc purificado. Recomendamos que el ADNc esté en 1X TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA); Sin embargo, también son aceptables 10 mM Tris pH 7,5–8, TE con bajo contenido de EDTA o H2O. Si el ADN de entrada es inferior a 26 µl, añada TE hasta un volumen final de 26 µl. P: ¿Cuál es el rango de tamaño esperado de las bibliotecas generadas con el kit de preparación de bibliotecas de ARN de entrada única/baja de NEBNext? R: Según el protocolo, el rango de tamaño esperado de la biblioteca de secuenciación de Illumina es de 300 pb a 350 pb. Ajuste el tiempo de fragmentación si se prefieren bibliotecas de diferentes tamaños de fragmentos. P: ¿Por qué las recomendaciones de número de ciclo de PCR de dilución del adaptador y amplificación de la biblioteca en este kit son diferentes a las del kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II FS? R: Las recomendaciones de este kit están optimizadas para la entrada de ADNc generada a partir del protocolo de síntesis y amplificación de ADNc de entrada única/baja aguas arriba del protocolo de preparación de la biblioteca. P: ¿El kit de preparación de bibliotecas de ARN de entrada única/baja de NEBNext incluye adaptadores y cebadores? R: No. Los adaptadores y cebadores se suministran por separado. P: ¿Cómo se deben recortar las secuencias de los adaptadores? R: Las secuencias de nuestros oligos utilizados en el flujo de trabajo son las siguientes: NEBNext Template Switching Oligo GCT AAT CAT TGC AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CAT rGrGrG NEBNext Single Cell RT Primer AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TV NEBNext Single Cell cDNA PCR Primer AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT Se pueden utilizar varias herramientas de recorte para recortar las lecturas que tienen estas secuencias en sus extremos. Recomendamos Flexbar v3.3.0 o posterior. Las instrucciones para recortar los adaptadores con Flexbar se pueden consultar aquí: https://github.com/nebiolabs/nebnext-single-cell-rna-seq. La longitud de lectura típica empleada para la secuenciación de células individuales es de 2 x 75 pb, pero puede variar según la distribución del tamaño del inserto. P: ¿Puedo usar este kit NEBNext con adaptadores y cebadores de otros proveedores que no sean NEB? R: Sí, debería ser posible usar adaptadores y cebadores de otros proveedores que no sean NEB con este kit NEBNext. El adaptador debe ser un adaptador con saliente T y el rendimiento final de la biblioteca puede ser ligeramente inferior al que se obtiene con los adaptadores NEBNext para Illumina®. Las instrucciones de uso con adaptadores con código de barras de longitud completa que no sean NEBNext y cebadores universales para PCR P5 y P7 se pueden encontrar en los manuales de los adaptadores NEBNext indexados/UMI. Estos manuales se pueden encontrar en neb.com/E7416 (ARN) o neb.com/E7395 (ADN). Seleccione el manual del kit NEBNext que vaya a utilizar. Los manuales están escritos específicamente para los adaptadores indexados/UMI de NEBNext; el mismo protocolo debería funcionar con otros adaptadores de diseño similar. Recomendamos realizar un experimento de prueba de principio con el kit de preparación de bibliotecas y los adaptadores indexados deseados, y utilizar muestras fungibles para optimizar las condiciones experimentales. P: ¿El kit incluye adaptador y cebadores? R: No. El kit se puede utilizar con los oligos multiplex NEBNext para Illumina. Para obtener una lista completa, consulte la Tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit de preparación de bibliotecas. Los manuales específicos del kit de oligos multiplex también contienen consejos para configurar las reacciones de PCR. Para conocer las opciones de equilibrio de color, consulte el Selector de oligos indexados NEBNext® para ver las combinaciones de códigos de barras válidas.