New England Biolabs, E6421L, módulo de síntesis y amplificación de ADNc de células individuales/bajo consumo NEBNext®

Categorías relacionadas con NEBNext Preparación de biblioteca de ARN para Illumina Materiales de especificación necesarios pero no suministrados Etanol al 80 % (recién preparado) Agua sin nucleasas Tubos DNA LoBind (Eppendorf® n.º 022431021) Gradilla o placa magnética (p. ej., Gradilla de separación magnética NEBNext® (NEB n.º S1515S), placa supermagnética Alpaqua® 96S (n.º A001322) o equivalente) Termociclador Microcentrífuga Vortex Kit de reactivos SPRIselect (Beckman Coulter®, Inc. n.º B23317) o perlas AMPure® XP (Beckman Coulter, Inc. n.º A63881) Analizador de fragmentos Agilent® Bioanalyzer® o similar y consumibles asociados ADNasa Tubos de tiras para PCR sin ARNasa (USA® Scientific 1402-1708) Preguntas frecuentes P: ¿Cuánto PBS se puede transferir de la recolección de células a la síntesis de ADNc? ¿Y protocolo de amplificación? R: Para obtener resultados óptimos, el arrastre de PBS debe limitarse a ≤5 µl. No se recomiendan volúmenes de arrastre mayores, ya que comprometerán el rendimiento y la calidad de los datos. P: ¿Qué tipos de células admite el módulo NEBNext de síntesis y amplificación de ADNc de células individuales/bajo consumo? R: El módulo está optimizado para su uso con diversos tipos de células eucariotas. Sin embargo, la lisis celular no es compatible con células fijas o células con paredes celulares (p. ej., células vegetales y fúngicas). Si se extrae ARN de buena calidad de estas muestras, se puede seguir la Sección 2 del manual del producto para ARN de bajo consumo para la síntesis, amplificación y generación de bibliotecas de ADNc. El módulo no es compatible con ARNm sin colas de poli(A) (p. ej., de células bacterianas). P: ¿Puedo resuspender las células en tampones/medios que no sean PBS antes de la recolección celular? R: Recomendamos encarecidamente que las células se resuspendan en tampón PBS antes de la recolección celular. Si el PBS solo no es una opción viable, las células pueden resuspenderse en PBS suplementado con BSA. Se pueden incluir hasta 0,5 ng de BSA en la reacción de síntesis y amplificación de ADNc. Si las células se resuspenden en un medio de cultivo celular, por ejemplo, DMEM con 10 % de FBS, el volumen de arrastre durante la recolección celular debe ser mínimo (10-15 nl). Para las células clasificadas, no utilice más de 5 µl de volumen de arrastre. Consulte estas preguntas frecuentes. P: ¿Es necesario clasificar las células en un reactivo específico? R: Recomendamos clasificar las células en tampón de lisis celular 1X, según las instrucciones del manual. P: ¿Se pueden utilizar células congeladas? R: Sí. Las células pueden clasificarse en tampón de lisis celular 1X, congelarse instantáneamente y almacenarse a -80 °C. Si, en cambio, las células se recogen en PBS o agua antes de congelarlas, prepare el tampón de lisis celular 1X según la sección 1.2 (Recolección y lisis celular) de los manuales suministrados con el kit de preparación de biblioteca de ARN de células individuales/bajo consumo NEBNext (NEB n.° E6420) o el módulo de síntesis y amplificación de ADNc de células individuales/bajo consumo NEBNext (NEB n.° E6421), teniendo en cuenta el volumen de almacenamiento de las células. P: ¿Se pueden lisar las células con otros tampones de lisis celular? R: No recomendamos lisar las células con tampones de lisis celular distintos del tampón suministrado. El kit es incompatible con tampones de lisis celular que contengan sales de guanidio o detergentes desnaturalizantes, como el SDS. P: ¿Cuánto tiempo se puede almacenar el ADNc sintetizado (antes de su amplificación) antes de la amplificación? R: El ADNc (antes de su amplificación) puede almacenarse de forma segura durante la noche a 4 °C o -20 °C. Si la muestra debe almacenarse durante más tiempo, añada 0,5 µl de tampón de lisis celular NEBNext 10X al ADNc (después de la RT en lugar de durante la PCR). Las muestras pueden almacenarse a -20 °C hasta 7 días, pero podría observarse una ligera disminución en el rendimiento. P: ¿Qué tipos de ARN son compatibles? R: El ADNc se sintetiza selectivamente directamente a partir de ARN con cola de poli(A), y el cambio de molde durante la transcripción inversa es más eficiente a partir de ARN molde con una estructura de capuchón 5'. Por lo tanto, el kit funciona de forma más eficiente con muestras de ARN con un número de integridad del ARN (RIN) alto ≥8. El kit no es adecuado para muestras de ARN FFPE altamente fragmentadas. P: ¿Es necesario purificar el ARN total de entrada? R: La muestra de ARN debe estar libre de sales (p. ej., Mg2+ o sales de guanidinio), agentes quelantes de cationes divalentes (p. ej., EDTA, EGTA, citrato) o compuestos orgánicos (p. ej., fenol y etanol). Si hay una cantidad excesiva de ADN genómico presente en las muestras de ARN, se puede realizar un tratamiento opcional con DNasa I. La DNasa I debe inactivarse/eliminarse después del tratamiento. P: Mi muestra de ARN total tiene un volumen > 8 µl. ¿Puedo seguir usando el módulo? R: Sí. Para ARN total en agua o con baja TE, puede usar hasta 11 µl eliminando la adición de agua en la Sección 2.3 (Transcripción inversa y cambio de plantilla). Para células clasificadas, no use más de 5 µl de volumen de arrastre. Consulte estas preguntas frecuentes. P: ¿El ADNc generado por el protocolo NEBNext Single Cell/Low Input cDNA Synthesis & Amplification es compatible con Nextera® XT de Illumina? R: Sí. El ADNc generado por este protocolo se puede utilizar en el kit Nextera XT para la preparación de bibliotecas. Recomendamos que la cantidad de entrada de ADNc sea de 100-300 pg para Nextera XT. P: ¿Cómo se deben recortar las secuencias adaptadoras? R: Las secuencias de nuestros oligos utilizados en el flujo de trabajo son las siguientes: NEBNext Template Switching Oligo GCT AAT CAT TGC AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CAT rGrGrG NEBNext Single Cell RT Primer AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TV NEBNext Single Cell cDNA PCR Primer AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT Se pueden utilizar varias herramientas de recorte para recortar las lecturas que tienen estas secuencias en sus extremos. Recomendamos Flexbar v3.3.0 o posterior. Las instrucciones para recortar los adaptadores usando Flexbar se pueden acceder aquí: https://github.com/nebiolabs/nebnext-single-cell-rna-seq La longitud de lectura típica empleada para la secuenciación de una sola célula es 2x75 pb, pero esto se puede cambiar dependiendo de la distribución del tamaño del inserto.