New England Biolabs, E6560S, Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript® II

Categorías relacionadas con ProtoScript: RT-PCR, síntesis de ADNc y transcriptasas inversas , aplicaciones, síntesis de ADNc, transcripción inversa (síntesis de ADNc), clonación de ARN, preguntas frecuentes. P: ¿Cómo elijo entre el kit LunaScript® RT SuperMix y los kits de síntesis de ADNc de primera cadena de ProtoScript? R: Los kits de síntesis de ADNc de primera cadena contienen diferentes transcriptasas inversas, cuyas principales diferencias residen en sus aplicaciones principales, formato y temperatura de reacción. A continuación, se presenta un resumen de nuestros tres kits de síntesis de ADNc de primera cadena. Producto Kit LunaScript RT SuperMix (E3010) Kit de síntesis de ADNc de primera hebra ProtoScript II (E6560) Kit de síntesis de ADNc de primera hebra ProtoScript (E6300) Transcriptasa inversa RT Luna Transcriptasa inversa ProtoScript II Transcriptasa inversa M-MuLV Formato Supermix Mezcla de reacción, mezcla de enzimas, cebador Mezcla de reacción, mezcla de enzimas, cebador Aplicación primaria RT-qPCR de dos pasos RT-PCR de punto final hasta 10 kb RT-PCR de punto final hasta 5 kb Aplicación secundaria RT-PCR de punto final hasta 3 kb RT-qPCR de dos pasos RT-qPCR de dos pasos Temperatura de reacción Hasta 65 °C (55 °C óptimo) Hasta 48 °C (42 °C óptimo) Hasta 45 °C (42 °C óptimo) Entrada de ARN 1 μg a 1 pg 1 μg a 1 pg 1 μg a 1 pg Incubación 25 °C 2 min, 55 °C 10 min, 95 °C 1 min 25 °C 5 min, 42 °C 60 min, 85 °C 5 min 25 °C 5 min, 42 °C 60 min, 85 °C 5 min Características adicionales Colorante de seguimiento azul, protocolo rápido de 13 min P: ¿Cuál es la diferencia entre E6560 y E6300? R: E6560 incluye la transcriptasa inversa M-MuLV H– en la mezcla de enzimas, mientras que E6300 incluye la transcriptasa inversa M-MuLV tipo wilde en la mezcla de enzimas. La transcriptasa inversa M-MuLV H– es una transcriptasa inversa M-MuLV mutante con actividad de ARNasa H reducida y mayor termoestabilidad. La enzima es activa hasta 50 °C, lo que proporciona mayor especificidad, mayor rendimiento de ADNc y más producto de ADNc de longitud completa. P: ¿Cuál es la temperatura de reacción para E6560? R: Recomendamos 42 °C para la transcripción inversa de rutina. Se pueden usar hasta 50 °C. La transcriptasa inversa M-MuLV (RNasa H–) es capaz de generar ADNc de más de 10 kb hasta 48 °C. P: ¿Es necesario el tratamiento con RNasa H antes de la amplificación por PCR? R: Para la mayoría de las reacciones de RT-PCR, no se requiere el tratamiento con RNasa H. Sin embargo, para algunos amplicones difíciles o ensayos sensibles, añada 2 U de RNasa H de E. coli a la reacción e incube a 37 °C durante 20 min. P: ¿Se pueden usar los productos de ADNc en análisis de PCR en tiempo real? R: Sí. Los productos de ADNc generados por la transcriptasa inversa ProtoScript II se pueden usar directamente para análisis de PCR en tiempo real. P: ¿Qué ADN polimerasa termoestable se puede usar para la PCR después de la síntesis de ADNc? R: Para la PCR descendente, recomendamos la mezcla maestra OneTaq 2X (NEB n.° M0482 o M0485) para la detección por PCR de hasta 5 kb, la mezcla maestra Q5 Hot Start High-Fidelity 2X (NEB n.° M0494) para la máxima fidelidad, o la mezcla maestra LongAmp Taq 2X (NEB n.° M0287) para obtener altos rendimientos a partir de productos más largos. P: ¿Cómo elijo entre la transcriptasa inversa Induro y los diferentes productos LunaScript y ProtoScript? R: La transcriptasa inversa Induro es una transcriptasa inversa codificada por intrones del grupo II, útil para la síntesis de ADNc a partir de transcripciones largas, ARN con estructuras secundarias fuertes y muestras de ARN con inhibidores. Por el contrario, los reactivos LunaScript son mezclas maestras. El kit LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) (NEB n.° E3025) es adecuado para la síntesis general de ADNc. Los productos LunaScript RT SuperMix (NEB n.° E3010/M3010) están optimizados para flujos de trabajo de RT-qPCR de dos pasos donde solo se requieren productos cortos de ADNc. LunaScript RT SuperMix también se incluye en el flujo de trabajo de secuenciación ARTIC SARS-CoV-2. Esta tabla describe las aplicaciones y características de cada uno. Productos de RT retrovirales con codificación intrónica Induro™ Transcriptasa inversa (NEB n.° M0681) Kit LunaScript® RT SuperMix (NEB n.° E3010) LunaScript RT SuperMix (NEB n.° M3010) Kit LunaScript RT Master Mix (NEB n.° E3025) Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript® II (NEB n.° E6560) Aplicaciones Síntesis de ADNc larga Muestras de ARN impuro Aplicaciones de ARN-seq (p. ej., secuenciación directa de ARN, secuenciación de ADNc de lectura larga, secuenciación de ARNt Aplicaciones Detección por RT-qPCR en 2 pasos Flujo de trabajo de ARN-seq Aplicaciones Flujo de trabajo de ARN-seq Detección por RT-qPCR en 2 pasos Síntesis general de ADNc Detección por RT-PCR en 2 pasos Aplicaciones Síntesis general de ADNc Flujo de trabajo de ARN-seq Detección por RT-PCR en 2 pasos ✓ Protocolo corto ✓ Elección flexible de cebadores, dNTP modificados ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Supermix ✓ Protocolo corto ✓ Colorante de seguimiento ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Elección flexible de cebadores ✓ Protocolo corto ✓ Colorante de seguimiento ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Elección flexible de cebadores ✓ El formato del kit incluye todos los componentes necesarios P: ¿Por qué tengo bajos rendimientos de ADNc? R: Hay varias causas para un bajo rendimiento de ADNc. Aquí hay algunas sugerencias para mejorar el rendimiento: Verifique la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante o BioAnalyzer (Agilent). El ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. El ARN debe tener una relación mínima A260/A280 de 1,7 o un número RIN mayor que 8. La precipitación con etanol seguida de un lavado con etanol al 70 % puede eliminar contaminantes como EDTA y guanidinio. La precipitación con cloruro de litio puede eliminar Polisacáridos. Un paso de purificación de ARN mediante kits de extracción de ARN o extracción con fenol/cloroformo puede eliminar proteínas contaminantes como las proteasas. Aumente la cantidad de ARN utilizado, especialmente si el ARN es poco abundante. P: ¿Cómo sé si mi ARN molde es de buena calidad? R: Un ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. Una relación de absorbancia A260/A280 superior a 1,7 o un número RIN superior a 8 en un BioAnalyzer suelen indicar ARN de alta calidad.