Kit de preparación de biblioteca de ADN FFPE NEBNext®, E6650S, de New England Biolabs

El ADN FFPE presenta numerosos desafíos para la preparación de bibliotecas, incluyendo la baja cantidad de material de partida y la alta variabilidad en el daño debido a los métodos de fijación, almacenamiento y extracción. Las regiones de interés suelen enriquecerse mediante enfoques híbridos basados ​​en captura, y estos flujos de trabajo requieren una gran cantidad de material de partida de una biblioteca de ADN diversa y uniforme. Categorías relacionadas ADN FFPE, biblioteca de secuenciación de próxima generación Especificaciones de preparación Materiales necesarios pero no suministrados Etanol al 80 % Agua libre de nucleasas 0,1X TE (Tris-HCl 1 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM) Tubos de PCR en tiras libres de ADNasa y ARNasa NEBNext Multiplex Oligos para Illumina® (www.neb.com/oligos) Soporte/gradilla magnético (NEB n.º S1515S, Alpaqua® cat. n.º A001322 o equivalente) Termociclador Agilent® Bioanalyzer® o TapeStation® y reactivos y consumibles asociados Tampón de dilución del adaptador NEB n.º B1430S o adaptador UMI de índice dual único NEBNext Tampón de dilución suministrado con los conjuntos de ADN del adaptador UMI de índice dual único NEBNext (NEB #E7395/E7874/E7876/E7878) Preguntas frecuentes P: ¿Qué tipos de muestras puedo usar con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext FFPE? R: El kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext® FFPE es compatible con muestras dañadas, incluyendo ADN fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE), así como otras muestras de ADN que se han dañado mediante otros procesos. Este es un método de preparación de bibliotecas basado en moléculas modificadas con saliente 3'-dA que se ligan a adaptadores que contienen un saliente 5'-dT. P: ¿Cuánto material de partida se requiere para el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext FFPE? R: Se recomiendan de 5 a 250 ng de ADN cizallado (p. ej., cizallamiento acústico). Consulte NEB n.° E6655 para obtener una versión de este kit que contiene reactivos para realizar la fragmentación enzimática utilizando NEBNext UltraShear™. P: ¿Se recomienda la selección del tamaño? R: No se recomienda la selección del tamaño para este flujo de trabajo, ya que la pérdida de muestra puede ser significativa con muestras muy dañadas, como el ADN FFPE. P: ¿Qué cantidad de entrada (nanogramos) se recomienda para la preparación de bibliotecas de enriquecimiento estándar frente a la de objetivo con muestras de ADN FFPE? R: Se recomienda una cantidad mínima de entrada de 100 ng de ADN FFPE para lograr un rendimiento y una complejidad de biblioteca suficientes a partir de muestras FFPE de baja calidad que se utilizan en flujos de trabajo de enriquecimiento de objetivo. Una cantidad de entrada mayor mejorará la complejidad. Para la preparación y secuenciación de bibliotecas estándar, se pueden utilizar de 5 a 250 ng de entrada; con una cantidad mayor se logra una mayor complejidad de la biblioteca. P: ¿Puedo usar este kit NEBNext con adaptadores y cebadores de otros proveedores? R: Sí. El adaptador debe ser un adaptador con saliente en T y el rendimiento final de la biblioteca puede ser ligeramente inferior al que se obtiene con los adaptadores NEBNext para Illumina®. Directrices de uso (aplican para adaptadores con código de barras de longitud completa que no sean de NEBNext y cebadores de PCR universales P5 y P7): Utilice un adaptador de 2,5 µl. Los adaptadores se utilizan normalmente a una concentración de 15-25 µM. La concentración y dilución óptimas del adaptador se tendrían que determinar experimentalmente. Omita la adición del USUARIO y la incubación del USUARIO de 15 min. Añada 3 µl de agua o TE a la muestra para compensar la diferencia de volumen para el siguiente paso. Es posible que haya que modificar las condiciones de limpieza de las microesferas de muestra para los oligos de otros proveedores. PCR con NEBNext MSTC™ FFPE Master Mix: utilice los cebadores de PCR suministrados con los adaptadores del proveedor utilizados. NO utilice los cebadores de PCR NEBNext Index Oligo. P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reparación de ADN NEBNext FFPE v2? R: No es raro ver un precipitado blanco en el tampón de reparación de ADN NEBNext FFPE v2. Si esto ocurre, deje que la mezcla alcance la temperatura ambiente y pipetee el tampón varias veces para disolver el precipitado, seguido de un vórtice rápido para mezclar. P: ¿El tratamiento de mi ADN con la mezcla de reparación de ADN FFPE v2 como parte del kit de preparación de biblioteca de ADN FFPE NEBNext dañará mi reacción posterior? R: No hemos visto que la mezcla de reparación de ADN FFPE NEBNext v2 tenga un efecto negativo en la mayoría de las aplicaciones posteriores. La mezcla de reparación actuará solo en bases dañadas, mellas y huecos. Sin embargo, este flujo de trabajo no se recomienda para su uso en estudios de detección de metilación. P: ¿Qué oligos multiplex NEBNext se pueden utilizar con el kit de preparación de biblioteca de ADN FFPE NEBNext? R: El kit de preparación de biblioteca de ADN FFPE NEBNext es compatible tanto con el adaptador truncado, no indexado NEBNext suministrado con los kits de cebadores de índice NEBNext como con los adaptadores de identificador molecular único (UMI) de índice dual único (UDI) de longitud completa. Para obtener una lista completa de todos los oligos compatibles, consulte la Tabla de selección de oligos multiplex NEBNext. Tenga en cuenta que el manual detalla diferentes protocolos para cada tipo de adaptador cuando se utiliza con muestras de ADN FFPE. P: ¿La mezcla FFPE DNA Repair v2 repara los enlaces cruzados ADN-proteína? R: No, la mezcla de reparación no repara los enlaces cruzados ADN-proteína. P: ¿La mezcla FFPE DNA Repair v2 repara los extremos 3' bloqueados? R: Sí, la mezcla de reparación pulirá el extremo 3' a un hidroxilo si hay un bloqueo en el extremo 3'. P: ¿Puede la mezcla FFPE DNA Repair v2 reparar daños en ADN tanto monocatenario como bicatenario? ¿O requiere ADN bicatenario como plantilla? R: La actividad de reparación completa de la mezcla FFPE DNA Repair v2 requiere dsDNA para la polimerización y la ligadura. Sin embargo, las bases dañadas como dU presentes en ssDNA se escindirán durante la reparación y no se incorporarán a la biblioteca de secuenciación. P: Si tuviera una plantilla de ADN con sitios de mutación (p. ej., 8-oxoguanina o citosinas deaminadas) directamente adyacentes en cadenas opuestas, ¿el tratamiento con FFPE DNA Repair v2 Mix causaría una rotura o corte en la doble cadena? R: No hemos probado la reparación de sitios de mutación adyacentes en cadenas opuestas. En este caso, si las dos bases dañadas se eliminan al mismo tiempo, podría producirse una rotura en la doble cadena, lo que resultaría en ADN fragmentado. Si, por otro lado, una reacción es más rápida que la otra y no ocurren simultáneamente, FFPE DNA Repair v2 Mix debería repararlas. P: ¿Qué longitudes de huecos se pueden reparar con FFPE DNA Repair v2 Mix? R: Se desconoce la longitud exacta de los huecos. Según nuestra experiencia, es de entre 5 y 10 nucleótidos.