New England Biolabs, E6655S, Kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext UltraShear® FFPE

El ADN FFPE presenta numerosos desafíos para la preparación de bibliotecas, incluyendo la baja cantidad de material de partida y la alta variabilidad en el daño debido a los métodos de fijación, almacenamiento y extracción. Las regiones de interés suelen enriquecerse mediante enfoques híbridos basados ​​en captura, y estos flujos de trabajo requieren una gran cantidad de material de partida de una biblioteca de ADN diversa y uniforme. Categorías relacionadas ADN FFPE, biblioteca de secuenciación de próxima generación Especificaciones de preparación Materiales necesarios pero no suministrados Etanol al 80 % Agua libre de nucleasas 0,1X TE (Tris-HCl 1 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM) Tubos de PCR en tiras libres de ADNasa y ARNasa NEBNext Multiplex Oligos para Illumina® (www.neb.com/oligos) Soporte/gradilla magnético (NEB n.º S1515S, Alpaqua® cat. n.º A001322 o equivalente) Termociclador Agilent® Bioanalyzer® o TapeStation® y reactivos y consumibles asociados Tampón de dilución del adaptador NEB n.º B1430S o adaptador UMI de índice dual único NEBNext Tampón de dilución suministrado con los conjuntos de ADN del adaptador UMI de índice dual único NEBNext (NEB Preguntas frecuentes ( n.° E7395/E7874/E7876/E7878): P: ¿Qué tipos de muestras puedo usar con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraShear FFPE? R: El kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraShear FFPE es compatible con muestras dañadas, incluido el ADN fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE). Este método de preparación de bibliotecas se basa en moléculas modificadas con saliente 3'-dA que se ligan a adaptadores que contienen un saliente 5'-dT. P: ¿Cuánto material de partida se requiere para el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraShear FFPE? R: Se recomiendan de 5 a 250 ng de ADN. Consulte el NEB n.° E6650 para obtener una versión de este kit que contiene reactivos para realizar la preparación de bibliotecas después del cizallamiento mecánico o acústico. P: Al preparar muestras con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraShear FFPE, ¿puedo usar soluciones con EDTA para el ADN de entrada? R: Sí, recomendamos que el ADN de entrada esté en Tris-EDTA (TE) pH 8.0 para este kit. Alternativamente, las muestras se pueden diluir en Tris 10 mM pH 8.0, TE 0.1X o agua. P: ¿Es realmente necesario agitar en vórtex la mezcla de enzimas NEBNext UltraShear antes de usarla? R: Sí, si no se agita en vórtex la mezcla de enzimas NEBNext UltraShear, los resultados pueden variar. P: ¿Qué tiempo de fragmentación se debe usar con el kit de preparación de bibliotecas de ADN FFPE NEBNext UltraShear para muestras de ADN FFPE? R: Para la mayoría de las muestras FFPE diluidas en TE 1X (validado en muestras DIN 1.5 a 7.0), se recomiendan 5 minutos de fragmentación a 37 °C para obtener un rendimiento óptimo, la calidad y el tamaño de la biblioteca. Es posible que sea necesario optimizar el tiempo de fragmentación para muestras FFPE de muy alta calidad (DIN > 7.0). P: ¿Se recomienda la selección del tamaño? R: No se recomienda la selección de tamaño para este flujo de trabajo, ya que la pérdida de muestra puede ser significativa con muestras muy dañadas, como el ADN FFPE. P: ¿Qué oligos multiplex NEBNext se pueden utilizar con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraShear FFPE? R: El kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraShear FFPE es compatible tanto con el adaptador truncado y no indexado NEBNext, suministrado con los kits de cebadores de índice NEBNext, como con los adaptadores de identificador molecular único (UMI) de índice dual único (UDI) de longitud completa. Para obtener una lista completa de todos los oligos compatibles, consulte la tabla de selección de oligos multiplex NEBNext. Tenga en cuenta que el manual detalla diferentes protocolos para cada tipo de adaptador cuando se utiliza con muestras de ADN FFPE. P: ¿Qué cantidad de entrada (nanogramos) se recomienda para la preparación de bibliotecas de enriquecimiento estándar frente a la diana con muestras de ADN FFPE? R: Se recomienda una cantidad mínima de entrada de 100 ng de ADN FFPE para lograr un rendimiento y una complejidad de biblioteca suficientes a partir de muestras FFPE de baja calidad destinadas a flujos de trabajo de enriquecimiento de dianas. Una cantidad mayor de entrada mejorará la complejidad. Para la preparación y secuenciación de bibliotecas estándar, se pueden utilizar de 5 a 250 ng de entrada; con una cantidad mayor, se logra una mayor complejidad de la biblioteca. P: ¿Puedo usar este kit NEBNext con adaptadores y cebadores de otros proveedores? R: Sí. El adaptador debe ser un adaptador con saliente T y el rendimiento final de la biblioteca puede ser ligeramente inferior al que se obtiene al usar los adaptadores NEBNext para Illumina®. Instrucciones de uso (aplican para adaptadores con código de barras de longitud completa que no sean NEBNext y cebadores universales para PCR P5 y P7): Utilice un adaptador de 2,5 µl. Los adaptadores se utilizan normalmente a una concentración de 15-25 µM. La concentración y dilución óptimas del adaptador se determinarían experimentalmente. Omita la adición del adaptador USER y la incubación de 15 min USER. Añada 3 µl de agua o TE a la muestra para compensar la diferencia de volumen para el siguiente paso. Es posible que sea necesario modificar las condiciones de limpieza de las microesferas de muestra para oligos de otros proveedores. PCR con NEBNext MSTC™ FFPE Master Mix: utilice los cebadores de PCR suministrados con los adaptadores del proveedor utilizados. NO utilice cebadores de PCR NEBNext Index Oligo. P: ¿Tratar mi ADN con la mezcla reparadora de ADN FFPE v2 como parte del kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext UltraShear FFPE FFPE dañará mi reacción posterior? R: No hemos observado que la mezcla reparadora de ADN NEBNext FFPE v2 afecte negativamente a la mayoría de las aplicaciones posteriores. La mezcla reparadora actuará solo sobre bases dañadas, mellas y huecos. Sin embargo, este flujo de trabajo no se recomienda para su uso en estudios de detección de metilación. P: ¿La mezcla reparadora de ADN FFPE v2 repara los enlaces cruzados de ADN-proteína? R: No, la mezcla reparadora no repara los enlaces cruzados de ADN-proteína. P: ¿La mezcla reparadora de ADN FFPE v2 repara los extremos 3' bloqueados? R: Sí, la mezcla de reparación pulirá el extremo 3' a un hidroxilo si hay un bloqueo en dicho extremo. P: ¿Puede la mezcla FFPE DNA Repair v2 reparar daños en ADN monocatenario y bicatenario? ¿O requiere ADN bicatenario como plantilla? R: La actividad reparadora completa de la mezcla FFPE DNA Repair v2 requiere dsADN para la polimerización y la ligación. Sin embargo, las bases dañadas, como las dU presentes en el ssADN, se extirparán durante la reparación y no se incorporarán a la biblioteca de secuenciación. P: Si tuviera una plantilla de ADN con sitios de mutación (p. ej., 8-oxoguanina o citosinas deaminadas) directamente adyacentes en hebras opuestas, ¿el tratamiento con la mezcla FFPE DNA Repair v2 causaría una muesca o rotura en la doble hebra? R: No hemos probado la reparación de sitios de mutación adyacentes en hebras opuestas. En este caso, si las dos bases dañadas se eliminan al mismo tiempo, podría producirse una rotura en la doble hebra, lo que resultaría en ADN fragmentado. Si, por otro lado, una reacción es más rápida que la otra y no ocurren simultáneamente, entonces la mezcla FFPE DNA Repair v2 debería repararlas. P: ¿Qué longitudes de gap se pueden reparar con la mezcla FFPE DNA Repair v2? R: Se desconoce la longitud exacta del gap. Según nuestra experiencia, está entre 5 y 10 nucleótidos. P: ¿Puedo fragmentar mi muestra de ADNg con NEBNext UltraShear® en tampones que no sean 1X TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA)? R: Las muestras de ADNg se pueden fragmentar con NEBNext UltraShear® con los tampones de elución de los kits de extracción de ADNg comunes, por ejemplo, Monarch® DNA Elution Buffer, Monarch® gDNA Elution Buffer, Monarch® gDNA Elution Buffer II, Buffer EB y Buffer AE, en lugar de 1X TE pH 8,0. Sin embargo, la fragmentación con NEBNext UltraShear es más lenta con muestras de ADNg fragmentadas en estos tampones de elución. Es necesario optimizar las condiciones de fragmentación y podría requerirse una incubación prolongada a 37 °C o 45 °C, en comparación con las muestras de ADNg en 1X TE a pH 8.0. Tampón de elución de ADN Monarch® (NEB n.° T1016): 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA pH 8,5 Tampón de elución de ADNg Monarch® (NEB n.° T3016): 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA pH 9,0 Tampón de elución de ADNg Monarch® II (NEB n.° T3056) o tampón AE: 10 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA pH 9,0 Tampón EB Qiagen: 10 mM Tris-HCl pH 8,5