Kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress®, E6800S, de New England Biolabs

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R: Contaminación por ARNasa Los minikits de preparación comerciales son una herramienta útil para la preparación de ADN molde, pero a menudo son la fuente de introducción de ARNasa A en la reacción de síntesis de proteínas in vitro. La inclusión del inhibidor de la ARNasa (NEB n.º M0314S, 20 unidades/reacción de 25 μl) a menudo supera este problema. El diseño del ADN molde está comprometido Asegúrese de que la secuencia del ADN molde sea correcta. La región codificante, así como las secuencias reguladoras, deben ser correctas y estar en marco para garantizar que la traducción se inicie correctamente y que se genere un producto de longitud completa. Las secuencias reguladoras no óptimas o el espaciamiento pueden afectar negativamente la eficiencia de la traducción. La iniciación de la traducción es un paso clave para una síntesis proteica exitosa. La estructura secundaria o los codones raros al comienzo del ARNm pueden comprometer el proceso de iniciación y afectar negativamente la síntesis proteica. La adición de una buena región de iniciación (p. ej., los primeros diez codones de la proteína de unión a maltosa) puede ayudar, suponiendo que se pueda tolerar la adición de residuos a la secuencia diana. Alternativamente, usar PCR para modificar el extremo 5' del gen diana puede ser una estrategia exitosa para eliminar elementos estructurales secundarios o codones raros. El ADN molde está contaminado Puede haber inhibidores de la transcripción o la traducción en el ADN. Un simple experimento de mezcla (ADN de control + ADN diana, comparado con ADN de control solo) revelará si hay inhibidores presentes. Los inhibidores en el ADN diana reducirán el rendimiento de la proteína de control. No utilice ADN purificado a partir de geles de agarosa, ya que a menudo contienen inhibidores de la traducción (p. ej., bromuro de etidio). El SDS residual de los protocolos de preparación de plásmidos es otro contaminante común y puede eliminarse mediante extracción con fenol:cloroformo y precipitación con etanol. Al realizar la precipitación con etanol, recomendamos el uso de acetato de sodio en lugar de acetato de amonio, un inhibidor conocido de la traducción. Tenga cuidado de eliminar todos los rastros de etanol. Las plantillas producidas por PCR deben estar libres de productos de amplificación no específicos. Estos contaminantes pueden contener señales de transcripción y, por lo tanto, competir por los componentes de transcripción y/o traducción y titularlos. Como resultado, los rendimientos pueden verse afectados y pueden producirse productos truncados no deseados. La concentración de ADN plantilla no es óptima La concentración de ADN plantilla es importante ya que la síntesis de proteínas in vitro es un equilibrio entre la transcripción y la traducción. Muy poca plantilla reduce la cantidad de ARNm traducido activamente, mientras que demasiada plantilla da como resultado la sobreproducción de ARNm y la sobrecarga del aparato traduccional. Recomendamos 250 ng de ADN plantilla para una reacción de 25 μl. La optimización con diferentes cantidades de ADN plantilla (por ejemplo, 25-1000 ng) puede mejorar el rendimiento de una proteína diana particular. Si se utilizó la absorbancia UV para calcular la concentración de ADN plantilla, tenga en cuenta que el ARN o el ADN cromosómico también absorberán la luz UV. Si su muestra tiene cantidades significativas de ARN o ADN cromosómico, la cantidad real de ADN plantilla puede ser menor que la cantidad calculada. La relación 260 nm/280 nm debe ser 1,8. El procesamiento de una parte del ADN plantilla en un gel de agarosa puede revelar la presencia de otros ácidos nucleicos, así como cualquier degradación o tamaño incorrecto del ADN plantilla. P: Al utilizar PURExpress, pude sintetizar la proteína diana, pero el producto de longitud completa no es una especie principal. A: Inicio y/o terminación de la traducción incorrectos. La producción de proteínas completas requiere un inicio y una terminación adecuados. Los sitios de entrada internos a los ribosomas y/o la terminación prematura pueden producir proteínas truncadas no deseadas. La iniciación en codones AUG no auténticos y la terminación prematura son difíciles de controlar. Si hay muchos codones raros presentes o la diana tiene un porcentaje inusualmente alto de un aminoácido en particular, la suplementación del ARNt "faltante" puede ser útil. P: ¿Dónde puedo encontrar preguntas frecuentes más detalladas sobre PURExpress? R: Haga clic para ver el conjunto completo de preguntas frecuentes sobre PURExpress. P: ¿Hay citas de PURExpress? R: Sí. Puede encontrar citas de PURExpress aquí.