Kit PURExpress® Δ RF123 de New England Biolabs, E6850S

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R: Los factores de liberación intervienen en la terminación de la traducción de proteínas al reconocer los codones de parada en una secuencia de ARNm. En este kit, los tres factores de liberación se suministran por separado, lo que permite a los usuarios realizar una reacción de síntesis de proteínas/experimento de visualización de ribosomas con o sin los factores de liberación de su elección. Para obtener información detallada sobre el uso, consulte el manual del producto. P: ¿Dónde puedo encontrar preguntas frecuentes más detalladas sobre PURExpress? R: Haga clic para ver el conjunto completo de preguntas frecuentes sobre PURExpress. P: ¿Al usar PURExpress, no pude sintetizar la proteína de control? R: Los componentes del kit están inactivados. Se requiere el almacenamiento de todos los materiales a -80 °C y se debe minimizar el número de ciclos de congelación y descongelación. Contaminación por nucleasas. Para evitar la contaminación por nucleasas, use guantes y utilice puntas y tubos libres de nucleasas. También recomendamos añadir un inhibidor de ARNasa (p. ej., NEB n.º M0314) a las reacciones. P: Al usar PURExpress, pude sintetizar la proteína diana, pero el producto completo no es una especie principal. A: Inicio y/o terminación de la traducción no correctos La producción de proteína de longitud completa requiere inicio y terminación adecuados. Los sitios de entrada internos del ribosoma y/o la terminación prematura pueden producir proteínas truncadas no deseadas. El inicio en codones AUG no auténticos y la terminación prematura son difíciles de controlar. Si hay muchos codones raros presentes o el objetivo tiene un porcentaje inusualmente alto de un aminoácido en particular, la suplementación del ARNt "faltante" puede ayudar. P: Al usar PURExpress, pude sintetizar la proteína de control, pero la muestra objetivo no está presente o está presente en un bajo rendimiento. R: Contaminación por ARNasa Los minikits de preparación comerciales son una herramienta útil para la preparación de ADN molde, pero a menudo son la fuente de introducción de ARNasa A en la reacción de síntesis de proteínas in vitro. La inclusión del inhibidor de ARNasa (NEB #M0314S, 20 unidades/25 μl de reacción) a menudo supera este problema. El diseño del ADN molde está comprometido Asegúrese de que la secuencia del ADN molde sea correcta. La región codificante, así como las secuencias reguladoras, deben ser correctas y estar en marco para garantizar que la traducción se inicie correctamente y que se produzca un producto de longitud completa. Las secuencias reguladoras no óptimas y/o el espaciamiento pueden afectar negativamente la eficiencia de la traducción. La iniciación de la traducción es un paso clave para una síntesis proteica exitosa. La estructura secundaria o los codones raros al comienzo del ARNm pueden comprometer el proceso de iniciación y afectar negativamente la síntesis proteica. La adición de una buena región de iniciación (por ejemplo, los primeros diez codones de la proteína de unión a maltosa) puede ayudar, suponiendo que se pueda tolerar la adición de residuos a la secuencia diana. Alternativamente, usar PCR para modificar el extremo 5' del gen diana puede ser una estrategia exitosa para eliminar elementos estructurales secundarios o codones raros. El ADN molde está contaminado Los inhibidores de la transcripción o la traducción pueden estar presentes en el ADN. Un simple experimento de mezcla (ADN de control + ADN diana, en comparación con ADN de control solo) revelará si hay inhibidores presentes. Los inhibidores en el ADN diana reducirán el rendimiento de la proteína de control. No utilice ADN purificado a partir de geles de agarosa, ya que a menudo contienen inhibidores de la traducción (p. ej., bromuro de etidio). El SDS residual de los protocolos de preparación de plásmidos es otro contaminante común y puede eliminarse mediante extracción con fenol:cloroformo y precipitación con etanol. Al realizar la precipitación con etanol, recomendamos el uso de acetato de sodio en lugar de acetato de amonio, un inhibidor conocido de la traducción. Tenga cuidado de eliminar todos los rastros de etanol. Las plantillas producidas por PCR deben estar libres de productos de amplificación no específicos. Estos contaminantes pueden contener señales de transcripción y, por lo tanto, competir por los componentes de transcripción y/o traducción y titularlos. Como resultado, los rendimientos pueden verse afectados y pueden producirse productos truncados no deseados. La concentración de ADN plantilla no es óptima La concentración de ADN plantilla es importante ya que la síntesis de proteínas in vitro es un equilibrio entre la transcripción y la traducción. Muy poca plantilla reduce la cantidad de ARNm traducido activamente, mientras que demasiada plantilla da como resultado la sobreproducción de ARNm y la sobrecarga del aparato de traducción. Recomendamos 250 ng de ADN plantilla para una reacción de 25 μl. La optimización con diferentes cantidades de ADN molde (p. ej., 25-1000 ng) puede mejorar el rendimiento de una proteína diana específica. Si se utilizó la absorbancia UV para calcular la concentración del ADN molde, tenga en cuenta que el ARN o el ADN cromosómico también absorben la luz UV. Si su muestra contiene cantidades significativas de ARN o ADN cromosómico, la cantidad real de ADN molde puede ser inferior a la calculada. La relación 260 nm/280 nm debe ser de 1,8. Analizar parte del ADN molde en un gel de agarosa puede revelar la presencia de otros ácidos nucleicos, así como cualquier degradación o tamaño incorrecto del ADN molde. P: ¿Existen referencias de PURExpress? R: Sí. Puede encontrar referencias de PURExpress aquí.