Kit IMPACT™ de New England Biolabs, E6901S

El sistema IMPACT™ (Purificación Mediada por Inteína con una Etiqueta de Unión a Quitina por Afinidad) es un novedoso sistema de purificación de proteínas que utiliza la actividad de autoescisión inducible de los elementos de empalme de proteínas, denominados inteínas, para separar la proteína diana de la etiqueta de afinidad. Categorías relacionadas Sistema IMPACT,, Expresión de proteínas bacterianas de E. coli,, Purificación por afinidad, Aplicaciones Purificación por afinidad y etiquetas de expresión,, Purificación de proteínas,, Etiqueta de afinidad IMPACT, Preguntas frecuentes P: ¿Qué sistemas ofrece NEB para la expresión y purificación de proteínas? R: El sistema de fusión y purificación NEBExpress® MBP (NEB# E8201) aprovecha el potente promotor Ptac y las señales de iniciación de la traducción de la proteína de unión a maltosa (MBP) para mejorar la solubilidad y los niveles de expresión de una proteína deseada en E. coli. El producto resultante es una proteína de fusión MBP, que luego se purifica y aísla en dos pasos sencillos: la elución de amilosa seguida de la escisión de la proteasa TEV y el aislamiento de la resina de Ni da como resultado una proteína diana altamente pura sin etiqueta. El sistema IMPACT™ (NEB# E6901) utiliza elementos de empalme de proteínas diseñados (inteínas) para purificar proteínas recombinantes mediante una sola columna de afinidad de quitina. Este sistema se distingue de otros sistemas de fusión de proteínas por su capacidad para separar una proteína recombinante de la etiqueta de afinidad sin el uso de una proteasa. Además, las proteínas recombinantes nativas que poseen un tioéster C-terminal se pueden aislar para aplicaciones como la semisíntesis de proteínas y el marcaje específico del sitio. El kit de expresión de proteínas K.lactis (NEB# E1000) proporciona un método sencillo para expresar un gen de interés en la levadura Kluyveromyces lactis. Las proteínas se pueden producir intracelularmente o secretar utilizando el vector de expresión integrativo pKLAC1 suministrado. El kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress® (NEB n.° E6800) es un sistema de transcripción/traducción acelular de E. coli, reconstituido a partir de componentes purificados. Los factores de transcripción/traducción de E. coli (excepto los ribosomas) están marcados con His. La proteína diana puede expresarse a partir de plantillas de ADN lineal o plasmídico que contienen un promotor T7. El sistema de síntesis de proteínas de E. coli acelular NEBExpress™ (NEB n.° E5360) es un sistema basado en extractos derivados de células de E. coli, diseñado para la producción in vitro de alto nivel de proteína recombinante a partir de genes clonados aguas abajo de un promotor T7 en plantillas de ADN lineal o plasmídico. El aislamiento eficiente de la proteína diana recombinante puede lograrse utilizando perlas magnéticas de Ni-NTA NEBExpress (NEB n.° S1423), columnas de centrifugación (NEB n.° S1427) o resina (NEB n.° S1428). Perlas magnéticas de Ni-NTA NEBExpress™ (NEB #S1423), columnas de centrifugación de Ni NEBExpress™ (NEB #S1427) y resina de Ni NEBExpress™ (NEB #S1428): una gama de productos de níquel inmovilizado para el aislamiento de proteínas marcadas con polihistidina (marcadas con His) a partir de lisados ​​celulares o reacciones de síntesis de proteínas acelulares. P: ¿Qué es IMPACT? R: IMPACT (Purificación Mediada por Inteína con una Etiqueta de Afinidad de Unión a Quitina) es un novedoso sistema de purificación de proteínas que permite purificar proteínas recombinantes sin etiqueta de afinidad en un solo paso cromatográfico. Este método se desarrolló en New England Biolabs (NEB) a partir de estudios sobre el mecanismo de empalme de proteínas (véanse las referencias en 1.10 y 1.11). Se distingue de otros sistemas de purificación por su capacidad para purificar una proteína recombinante con su secuencia nativa mediante una sola columna de afinidad, sin el uso de una proteasa. El sistema IMPACT utiliza la actividad de autoescisión inducible de un elemento de empalme de proteínas diseñado (inteína) para separar la proteína diana de la etiqueta de afinidad. La proteína diana se fusiona a una etiqueta compuesta por la inteína y el dominio de unión a quitina (CBD), lo que permite la purificación por afinidad del precursor de fusión en la columna de quitina. La inteína sufre una escisión específica mediante un reactivo de tiol o un cambio de pH y temperatura que libera la proteína diana de la etiqueta unida a quitina, lo que resulta en una purificación de la proteína diana en una sola columna. El sistema IMPACT incluye una serie de vectores de expresión de E. coli que utilizan inteínas diseñadas de 134 a 454 residuos de aminoácidos. Estos vectores están diseñados para la expresión y purificación de proteínas en E. coli, así como para la manipulación de proteínas como el marcaje, la ligación y la ciclización. El kit IMPACT, así como los vectores que se venden por separado, está disponible para ayudarle a alcanzar su objetivo de investigación. La compatibilidad de los múltiples sitios de clonación de los vectores permite la inserción del mismo fragmento del gen diana en diferentes vectores para una expresión y purificación óptimas. El gen que codifica la proteína diana se inserta en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión IMPACT para crear una fusión en marco entre el gen diana y la etiqueta de afinidad, compuesta por el dominio de unión a inteína y quitina (CBD, 52 residuos de aminoácidos). Cuando se pasan extractos crudos de células de E. coli inducidas por una columna de quitina, la proteína de fusión de la proteína diana, inteína-CBD, se une a las microesferas de quitina, mientras que todos los demás contaminantes se eliminan de la columna. La escisión en columna se induce a 4 °C mediante la adición de un agente reductor (como DTT) o mediante un cambio de temperatura y pH (vectores pTWIN). La proteína diana se libera mientras la etiqueta inteína-CBD permanece unida a la columna, lo que resulta en una purificación de la proteína diana en una sola columna. El kit IMPACT contiene vectores de expresión que permiten la fusión de la etiqueta inteína escindible al extremo C-terminal (pTXB1) o al extremo N-terminal (pTYB11) de la proteína diana. Esta flexibilidad en la construcción de proteínas de fusión maximiza la probabilidad de expresión y purificación exitosas de una proteína diana. Los vectores pTWIN (#N6951S y #N6952S) ofrecen numerosas ventajas: (1) el aislamiento sencillo de proteínas nativas sin el uso de un reactivo tiol, utilizando el cambio de pH y temperatura (Inteína 1); (2) el aislamiento de proteínas con una cisteína N-terminal [para la ligadura mediada por inteína (IPL)] o un residuo distinto de la metionina sin el uso de proteasas exógenas, que pueden ser costosas e inespecíficas; (3) la purificación de proteínas con un tioéster C-terminal para su uso en reacciones de IPL que pueden insertar aminoácidos no codificados en una proteína o marcar una proteína expresada en bacterias; (4) la generación de especies proteicas circulares. Todos los vectores utilizan un promotor T7 y el gen lacI para proporcionar un control riguroso de la expresión del gen de fusión. La unión del represor lac a la secuencia operadora lac inmediatamente aguas abajo del promotor T7 suprime la expresión basal del gen de fusión en ausencia de inducción de IPTG. Todos los vectores son portadores del marcador del gen Ampr (el gen bla), que confiere resistencia a la ampicilina a la cepa huésped, excepto pKYB1 (#N6706S), que contiene el gen de resistencia a la kanamicina. P: ¿Cuáles son las ventajas del sistema IMPACT? A: Purificación en columna única - sin pasos adicionales para eliminar la etiqueta de afinidad Produce una secuencia de aminoácidos nativa Fusión de una proteína objetivo al extremo C o N de la etiqueta de inteína NO se requieren proteasas para eliminar la etiqueta de afinidad de la proteína objetivo Uso de reactivo tiol o cambio de pH y temperatura para inducir la escisión en columna Aislamiento de proteínas con o sin un residuo de metionina N-terminal Producción de proteínas que poseen una cisteína N-terminal y/o un tioéster C-terminal para su uso en el etiquetado, ligadura y ciclización de proteínas [Ver Parte 6: Aplicaciones: Ligadura y etiquetado de proteínas] Promotor T7 para expresión de alto nivel y regulación estricta de la transcripción Semisíntesis de proteínas: la capacidad de crear un tioéster en el extremo C para la ligadura con un péptido o etiqueta de cisteína que contiene N-terminal [Ver Parte 6: Aplicaciones: Ligadura y etiquetado de proteínas] La capacidad de etiquetar la Extremo C de la proteína diana [Ver Parte 6: Aplicaciones: Ligadura y marcaje de proteínas] Los vectores IMPACT pTYB21 (NEB n.° N6709) y pTYB22 (NEB n.° N6710) contienen un MCS compatible con otros vectores de expresión NEB. P: ¿Qué vectores incluye el kit IMPACT? R: El kit IMPACT incluye tres vectores de expresión de E. coli, lo que permite la fusión de la etiqueta inteína escindible al extremo C (pTXB1) o al extremo N (pTYB11) de la proteína diana. El vector pMXB10 sirve como control positivo para la expresión y la purificación, y también puede utilizarse como vector de clonación. pTXB1 (#N6707S) contiene una miniinteína del gen gyrA de Mycobacterium xenopi (inteína GyrA Mxe; 198 residuos de aminoácidos) que se ha modificado para experimentar una escisión inducida por tiol en su extremo N-terminal (Evans, TC, et al. (1998) Semisíntesis de proteínas citotóxicas mediante un elemento de empalme de proteínas modificado. Protein Sci. 7, 2256–2264; Southworth, MW, et al.(1999) BioTechniques 27, 110–120). El vector permite la purificación de una proteína diana sin aminoácidos adicionales mediante la clonación en los sitios NdeI y SapI. La proteína objetivo se fusiona en su extremo C a una etiqueta de inteína autoescindible (~28 kD) que contiene el dominio de unión de quitina (CBD, 6 kDa), lo que permite la purificación por afinidad del precursor de fusión en una columna de quitina. El vector pTYB11 (#N6701S) utiliza una inteína del gen VMA1 de Saccharomyces cerevisiae (intemína Sce VMA1; 454 aminoácidos) (Chong, S. et al. (1998) Utilizando la actividad de escisión C-terminal de un elemento de empalme de proteínas para purificar proteínas recombinantes en un solo paso cromatográfico. Nucl. Acids Res. 26, 5109–5115; Chong, S., et al. (1998) Modulación del empalme de proteínas de la inteína ATPasa de membrana vacuolar de Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 273, 10567–77). La proteína diana se fusiona en su extremo N a una etiqueta inteína-CBD VMA1 autoescindible (56 kD); La etiqueta permite la purificación por afinidad del precursor de fusión en una columna de quitina. El vector está diseñado para permitir la purificación de una proteína diana sin aminoácidos adicionales, o sin un residuo de metionina N-terminal, mediante la clonación de su extremo 5' en el sitio SapI. El vector de control, pMXB10 (#N6903S), derivado de pTXB1, lleva la proteína diana de control, la proteína de unión a maltosa (MBP), ya insertada aguas arriba de la inteína-CBD de Mxe GyrA. La inducción produce la fusión MBP-GyrA inteína-CBD que, cuando se escinde, resulta en la elución de MBP. Las regiones polienlazadoras que flanquean la región codificante para MBP se pueden usar convenientemente para clonar un gen de interés. Sin embargo, después de la escisión de la inteína, la proteína diana contendrá aminoácidos adicionales en su extremo C-terminal, incluyendo (LEY), que ha tenido una alta tasa de escisión exitosa. Los vectores IMPACT utilizan un promotor T7 para proporcionar un control estricto de la expresión del gen de fusión en E. coli (Dubendorff, JW y Studier, FW (1991) Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219, 45–59.). Los vectores IMPACT llevan el marcador del gen Ampr (el gen bla), que transmite resistencia a la ampicilina a la cepa huésped; un vector, pKYB1 (#N6706S), es resistente a la kanamicina (disponible por separado). P: Si mi proteína objetivo es sensible a DTT, ¿qué vector(es) debo usar? R: Puede usar el vector pTWIN1 o pTWIN2. La fusión de una etiqueta de inteína (Inteína 1) al extremo N de una proteína objetivo permite la purificación de proteínas en una columna con un cambio de pH y temperatura. No se requieren reactivos de tiol para la escisión. El extremo N-terminal de una proteína diana puede fusionarse al extremo C-terminal (un Asn) de la inteína 1 de los vectores pTWIN (la inteína Ssp DnaB). Un CBD, presente en el extremo N-terminal de la inteína Ssp DnaB, facilita la purificación mediante una resina de quitina. La cisteína (Cys1) del extremo N-terminal de la inteína se ha sustituido por una alanina para bloquear la reacción de empalme. La inteína Ssp DnaB con esta mutación sufre una escisión dependiente de la temperatura y el pH del enlace peptídico entre el extremo C-terminal de la inteína y el aminoácido aguas abajo. Esto ocurre mediante la ciclización de la cadena lateral Asn del extremo C-terminal para formar un anillo de succinimida con la consiguiente rotura del enlace peptídico. P: ¿Qué es la ligadura de proteínas mediada por inteína (IPL)? R: La reacción IPL permite la ligadura de un péptido sintético o una proteína con un residuo de cisteína N-terminal al extremo C-terminal de una proteína expresada en bacterias mediante un enlace peptídico nativo [Evans et al., (1998) Protein Sci.7, 2256-2264]. El protocolo IPL emplea los vectores de fusión IMPACT C-terminal para expresar y purificar una proteína de interés y generar un tioéster en su extremo C-terminal. Para IPL, recomendamos el uso de pTXB1 siempre que sea posible. La reacción IPL aplica la química descrita para la "ligadura química nativa", que fusiona dos péptidos sintéticos cuando la cisteína N-terminal de un péptido ataca a un tioéster C-terminal de otro péptido [Dawson et al., (1994) Science 266, 776-779; Tam et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA92, 12485-12489]. Inicialmente, se forma un nuevo enlace tioéster mediante transtioesterificación, que implica el ataque del grupo sulfhidrilo del residuo de cisteína N-terminal al tioéster C-terminal. El producto de la ligadura transitoria experimenta entonces una transposición espontánea de acilo SN de un tioéster a un enlace peptídico estable. Esta técnica también se ha descrito como "ligación de proteínas expresadas" [Muir et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95, 6705-6710; Severinov y Muir (1998) J. Biol. Chem. 273, 16205-16209]. P: ¿Para qué se ha utilizado la IPL? A: Debido a que la IPL permite la fusión de péptidos sintéticos, así como proteínas expresadas en bacterias, a una proteína expresada en el sistema IMPACT, la IPL se ha utilizado de diversas maneras, incluyendo: La expresión de proteínas citotóxicas [Evans et al., (1998) Protein Sci.7: 2256-2264]. El marcaje de proteínas con compuestos radiactivos, así como con péptidos sintéticos que contienen biotina o fluoresceína [Chong et al., (1997) Gene 192: 277-281; ​​Evans et al., (1998) Protein Sci.7: 2256-2264, Muir et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710] El estudio de interacciones proteína-proteína [Severinov et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:16205-16209] La generación de sustratos de quinasas variando el sitio de reconocimiento de la quinasa a nivel de proteína en lugar de a nivel de ADN [Ghosh, I. et al., (2004 J. of Imm. Methods. 293:85-95; Xu, J. et al., (2004) Biotechniques. 36: 976 -981.] La generación de sustratos de fosfatasa [Kochinyan, S. et al. (2007) Uso de matrices de fosfoproteínas mediadas por inteína para estudiar la especificidad del sustrato de las fosfatasas proteicas. Biotechniques 42(1): 63-9] El marcaje isotópico de proteínas para análisis de RMN [Xu et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,388-393] Generación de sustratos para proteínas Matrices [Sun, L., et al., (2004) Biotechniques. 37:430-443]. Incorporación específica de sitios de fracciones lipídicas en una proteína [Rak et al., (2003) Science 302, 646-650]. Para obtener más información, consulte las preguntas frecuentes detalladas de IMPACT. P: ¿Dónde puedo encontrar todas las preguntas frecuentes de IMPACT? R: Preguntas frecuentes de IMPACT. P: ¿Qué columna de gravedad recomiendan? R: Recomendamos la línea de columnas Econo de 2,5 cm (diámetro interno) de Bio-Rad o la Kontes Flex-Column. El tamaño de las columnas (diámetro interno y longitud) se puede aumentar o reducir y debe basarse en la cantidad de resina necesaria para aislar la proteína de interés con rendimientos suficientes. P: ¿Qué cebadores de secuenciación recomiendan para los vectores pTXB1 y pTYB21? R: Para secuenciar un gen clonado en el vector de fusión C-terminal pTXB1, recomendamos usar el cebador universal T7. (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'), que es complementario al promotor T7 y produce una secuencia en la dirección de la transcripción. Este cebador, junto con el cebador Mxe Intein Reverse II (5'-GAT TGC CAT GCC GGT CAA GG-3') o el cebador Mxe Intein Reverse (5'-GGC ACG ATG TCG GCG ATG-3'), puede utilizarse para secuenciar el inserto. El cebador Mxe Intein Reverse II se anela a unos 110 pb del extremo 5' de la inteína Mxe. El cebador Mxe Intein Reverse se anela a unos 50 pb corriente abajo del extremo 5' del gen.