New England Biolabs, E7103L, preparación de biblioteca de ADN NEBNext® Ultra™ II con perlas de purificación de muestras

Categorías relacionadas Preparación de bibliotecas de ADN para Illumina, Análisis de metilación de ADN por conversión de bisulfito, Automatización para la preparación de bibliotecas NGS NEBNext®, Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Etanol al 80 % (recién preparado) Agua sin nucleasas 0,1X TE (1 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) Tubos DNA LoBind (Eppendorf n.º 022431021) Oligos multiplex NEBNext para Illumina (para obtener una lista completa, visite www.neb.com/oligos) Gradilla o placa magnética (p. ej., Gradilla de separación magnética NEBNext® (NEB n.º S1515S), Placa supermagnética Alpaqua ® 96S (n.º A001322) o equivalente) Máquina de PCR Opcional: Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 o Tris/NaCl, pH 8,0 (10 mM Tris, 10 mM NaCl) (para dilución del adaptador de entrada de ADN ≤ 100 ng) Temperatura de almacenamiento: Paquete 1: NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit para Illumina - Almacenar a -20 °C Paquete 2: NEBNext Sample Purification Beads - Almacenar a temperatura ambiente. No congelar. Preguntas frecuentes P: ¿Para qué tipo de preparación de muestra/construcción de biblioteca puedo usar el NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit para Illumina? R: El NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit para Illumina es compatible con protocolos que requieren un saliente 3' A en las moléculas de la biblioteca para facilitar la ligadura a adaptadores que contienen un saliente 5' T, como la preparación de bibliotecas para secuenciación en la plataforma Illumina. En este momento hemos validado el Ultra II DNA Library Prep Kit solo en la plataforma Illumina. P: ¿Qué tipo y cuánto material de partida necesito usar al preparar bibliotecas usando el NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit para Illumina? R: Se recomiendan 500 pg -1 ug de ADN fragmentado. P: ¿Es necesaria la selección de tamaño y cuál es el método recomendado? R: Sí, recomendamos la selección de tamaño mediante microesferas SPRIselect o AMPure XP al crear bibliotecas a partir de entradas de ADN > 50 ng. No se recomienda la selección de tamaño si la entrada de ADN es menor o igual a 50 ng. El kit Ultra II también es compatible con otros métodos de selección de tamaño, como gel de agarosa y E-gel. Se incluye un protocolo detallado de selección de tamaño, con un tamaño de fragmento de ADN que varía de 150 pb a 500-700 pb (tamaño final de la biblioteca: 250-800 pb). P: ¿Puedo usar el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II para reactivos Illumina para preparar bibliotecas para secuenciación en el Ion Torrent PGM o Proton? R: No. Los adaptadores proporcionados para el Ion Torrent de ThermoFisher tienen extremos romos en lugar de salientes 5'-T. P: ¿Puede NEB proporcionar alguno de los reactivos para el paso de generación de clústeres o para la secuenciación propiamente dicha? R: No. P: ¿Estos reactivos están disponibles en un formato personalizado, un formato más grande o en formatos de 96 pocillos? R: Sí, podemos adaptarnos a formatos personalizados. Para obtener más información, póngase en contacto con nuestro departamento OEM en custom@neb.com. P: Actualmente utilizo las perlas Agencourt Ampure XP. ¿Serán las perlas de purificación de muestras NEBNext un sustituto adecuado? R: Sí, las perlas de purificación de muestras NEBNext pueden sustituir a las perlas Ampure en su flujo de trabajo. Siga los protocolos de selección de tamaño y limpieza de la reacción del manual del kit de preparación de bibliotecas de ADN Ultra II. P: ¿Puedo utilizar este kit NEBNext con adaptadores y cebadores de otros fabricantes que no sean NEB? R: Sí, debería ser posible utilizar adaptadores y cebadores de otros fabricantes que no sean NEB con este kit NEBNext. El adaptador debe ser un adaptador con saliente en T y el rendimiento final de la biblioteca puede ser ligeramente inferior al que se obtiene con los adaptadores NEBNext para Illumina®. Las instrucciones de uso con adaptadores con código de barras de longitud completa que no sean NEBNext y cebadores universales para PCR P5 y P7 se encuentran en los manuales de los adaptadores NEBNext indexados/UMI. Estos manuales se encuentran en neb.com/E7416 (ARN) o neb.com/E7395 (ADN). Seleccione el manual del kit NEBNext que vaya a utilizar. Los manuales están escritos específicamente para los adaptadores NEBNext indexados/UMI; el mismo protocolo debería funcionar con otros adaptadores de diseño similar. Recomendamos realizar un experimento de prueba de principio con el kit de preparación de bibliotecas y los adaptadores indexados deseados, y utilizar muestras desechables para optimizar las condiciones experimentales. P: ¿Qué hago si veo un precipitado en el tampón de reacción de preparación de extremos Ultra II? R: Es frecuente ver un precipitado blanco en el tampón de reparación de extremos Ultra II. Si esto ocurre, deje que la mezcla alcance la temperatura ambiente y pipetee el tampón varias veces para disolver el precipitado, seguido de una agitación rápida en vórtex para mezclar. P: ¿El kit incluye adaptador y cebadores? R: No. El kit se puede usar con los oligos multiplex NEBNext para Illumina. Para obtener una lista completa, consulte la Tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit de preparación de bibliotecas. Los manuales específicos de los kits de oligos multiplex también incluyen consejos para configurar las reacciones de PCR. Para conocer las opciones de balance de color, consulte el Selector de oligos de índice NEBNext® para obtener combinaciones de códigos de barras válidas.