New England Biolabs, E7120S, NEBNext® Kit enzimático de metil-seq

Este kit ya no se suministra con cebadores de secuenciación. NEB recomienda usar Categorías relacionadas Conversión enzimática para análisis de metilación de ADN,, Automatización para preparación de bibliotecas NGS NEBNext®,, Análisis de metilomas, Materiales de especificación Requeridos pero no suministrados Instrumento Covaris® S2 u otro equipo de fragmentación Tubos de tiras de PCR Formamida (Sigma n.º F9037-100 ml) o NaOH 0,1 N Etanol al 80 % • 0,1 X TE, pH 8,0 Agua sin nucleasas Soporte/gradilla magnética, como la gradilla de separación magnética NEBNext (NEB n.º S1515) Máquina de PCR Bioanalyzer®, TapeStation® y consumibles asociados u otro analizador de fragmentos Preguntas frecuentes P: ¿Qué tipos de muestras se pueden procesar utilizando el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq y el módulo de conversión enzimática de metil-seq? R: NEBNext Enzymatic Methyl-seq se puede utilizar con ADN genómico, ADN libre de células y ADN FFPE. P: ¿Cuáles son los insumos recomendados para el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq? R: El protocolo se ha optimizado para insumos de entre 10 y 200 ng. También hay disponible un protocolo modificado para insumos de hasta 500 ng. P: ¿Cuál es la diferencia entre el kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq y el módulo de conversión Enzymatic Methyl-seq? R: El kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq contiene todos los componentes necesarios para crear una biblioteca EM-seq, incluyendo reactivos para la oxidación de 5-mC/5-hmC y la desaminación de citosina, reactivos para la construcción de bibliotecas y el adaptador EM-seq, así como la mezcla maestra NEBNext Q5U y cebadores únicos duales para la amplificación de la biblioteca. El Módulo de Conversión Enzimática de Metil-seq no contiene reactivos para la construcción y amplificación de bibliotecas, ni adaptadores ni cebadores. P: ¿Qué tampones se recomiendan para el cizallamiento de ADN en los flujos de trabajo de Metil-seq Enzimático NEBNext® (EM-seq™)? R: Para usar con los Kits de Metil-seq Enzimático NEBNext® (NEB n.° E7120, n.° E8015), el ADN debe cizallarse en uno de los siguientes tampones: Tris-HCl 10 mM pH 7,5 o pH 8,0, TE 1X (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM) o TE bajo (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM). No se recomienda cizallar el ADN de entrada en TE 0,1X (Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM) ni en agua. Al utilizar los módulos de conversión enzimática de metil-seq NEBNext (NEB n.° E7125, n.° E8020), el ADN no debe estar en un tampón que contenga EDTA antes de proceder con la reacción de oxidación. Por lo tanto, se recomienda cizallar el ADN en Tris 10 mM, pH 8,0. Como alternativa, si se cizalla en TE 1X o TE bajo, se requiere una limpieza de la columna o microesfera seguida de una elución en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 o agua sin nucleasas. P: ¿Cuál es la concentración del adaptador EM-seq y de los cebadores índice EM-seq? R: El adaptador EM-seq es de 15 µM y los cebadores índice EM-seq son de 10 µM. P: ¿Se puede almacenar el tampón TET2 "activo" durante más de 4 meses? R: No. El tampón TET2 "activo" debe desecharse después de 4 meses. P: ¿Por qué, en algunas etapas del protocolo EM-seq, las perlas de purificación de muestras NEBNext se comportan de forma diferente al purificar la muestra? R: El comportamiento de las perlas varía según la purificación y el paso previo de la reacción EM-seq. Se debe tener especial cuidado después de la desaminación de APOBEC, ya que las perlas tienden a aglutinarse con mayor facilidad. No seque demasiado las perlas antes de la elución del ADN en este paso, ya que esto puede dificultar la resuspensión de las perlas y reducir la recuperación de ADN. P: ¿Cuál es el tamaño esperado de una biblioteca EM-seq? R: Las bibliotecas EM-seq estándar tienen aproximadamente 370-420 pb. Se pueden lograr insertos más grandes, de 470-520 pb, utilizando el protocolo modificado incluido en el manual. P: ¿Cómo se deben secuenciar las bibliotecas EM-seq? R: Para la secuenciación de Illumina, la longitud de lectura se determina en última instancia por el tamaño de la biblioteca. Las bibliotecas de tamaño estándar se pueden secuenciar utilizando 2 lecturas de 76 bases o 2 lecturas de 100 bases. Se pueden usar 2 lecturas de 150 bases para bibliotecas de insertos más largas. P: ¿Cómo se deben analizar los datos de secuenciación de EM-seq™? R: Las bibliotecas EM-seq secuenciadas ofrecen el mismo resultado que las bibliotecas de bisulfito, con la citosina secuenciada como timina y 5mC o 5hmC secuenciados como citosina. Se pueden usar pipelines establecidos para el análisis de datos de bisulfito. También disponemos de un pipeline de demostración y datos de ejemplo en la biblioteca de GitHub: https://github.com/nebiolabs/EM-seq/ P: ¿Se puede sustituir el adaptador EM-seq por otro adaptador? R: No se recomienda. El adaptador EM-seq se ha optimizado para su uso con el kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq, y la sustitución por otro adaptador probablemente reducirá el rendimiento. P: ¿Las bibliotecas EM-seq son direccionales o no direccionales? R: Las bibliotecas EM-seq son direccionales. P: ¿Se pueden usar otros tampones en lugar del tampón de elución EM-seq suministrado? R: El tampón de elución EM-seq debe usarse cuando se indique en el protocolo, excepto en el caso de almacenamiento a largo plazo de bibliotecas EM-seq amplificadas por PCR, donde son posibles otras opciones (especificadas en el manual). P: ¿Cómo se preparan bibliotecas a partir de ADN libre de células (cfDNA) con el kit NEBNext® EM-seq (NEB n.° E7120)? R: Con cfDNA, no es necesario cizallar el ADN antes de la preparación de la biblioteca. Se pueden transferir entre 10 y 200 ng de cfDNA directamente a la preparación de la biblioteca de ADN NEBNext Ultra II, y luego se siguen los pasos de conversión enzimática EM-seq y amplificación de la biblioteca según lo descrito en el manual del producto. P: ¿Se pueden preparar bibliotecas a partir de ADN FFPE con el kit NEBNext® EM-seq (NEB n.° E7120)? R: Sí, se pueden preparar bibliotecas utilizando entradas de ADN FFPE de 10 a 200 ng. El ADN debe cizallarse y las bibliotecas deben construirse según el Manual de EM-seq. Puede que sea necesario optimizar los ciclos de PCR, pero recomendamos aumentarlos al menos en 2 ciclos para las entradas de 10 ng y 50 ng (es decir, para 10 ng, utilizar al menos 10 ciclos de PCR y para 50 ng, utilizar al menos 8 ciclos de PCR). Tenga en cuenta que las bibliotecas preparadas a partir de ADN FFPE pueden tener mayores niveles de metilación en los contextos CHH y CHG. Sin embargo, el uso de un filtro 3xC (disponible en el pipeline de Bismark) o similar reduce el nivel de metilación. El filtro elimina las lecturas que contienen 3 o más C consecutivas sin convertir en el contexto no CpG (es decir, CHG/CHH). P: ¿Qué niveles de conversión son típicos con los ADN de control suministrados en el kit de EM-seq? R: El kit EM-seq incluye dos controles de ADN: ADN lambda sin metilar y ADN pUC19 metilado con CpG. Normalmente, se detecta hasta un 0,5 % de metilación en lambda sin metilar, lo que indica una eficiencia de conversión del 99,5 %. Esto es similar a la eficiencia de conversión observada con WGBS. En el caso del pUC19 metilado con CpG, se detecta una metilación del 96-98 % tanto con el flujo de trabajo EM-seq como con WGBS. Dado que el ADN pUC19 está metilado enzimáticamente, es probable que no se haya alcanzado el 100 % de metilación y que no todos los CpG estén metilados. P: ¿Hay hojas de muestra disponibles para usar con los oligos multiplex NEBNext® para EM-seq? R: Las hojas de muestra se encuentran en la sección "Instrucciones de uso" de la página del producto. P: ¿Se puede usar ADN fragmentado enzimáticamente como material de partida para EM-seq™? R: NEBNext UltraShear™ es el único reactivo de fragmentación enzimática que recomendamos para su uso previo al flujo de trabajo de EM-Seq. No recomendamos otros métodos de fragmentación enzimáticos, ya que pueden afectar las marcas de metilación del ADN. Para usar EM-seq™ con NEBNext UltraShear™, siga el protocolo de la «Sección 3» del manual enlazado a continuación: https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manualm7634.pdf?rev=64e0e81d781748dba43702e4a78da971&hash=09F5E6499849C9045DFAE1A3AB3BDAA9 P: ¿Cómo se deben diluir los controles para aplicaciones que implican secuenciación superficial? A: Para aplicaciones en las que se secuencia a una profundidad inferior a 10 M de lecturas pareadas, recomendamos las siguientes diluciones de control en función de la cantidad de entrada de muestra: 200 ng: Sin dilución de ADN de control 10 ng: dilución 1:10 de ADN de control 1 ng: dilución 1:25 de ADN de control 0,1 ng: dilución 1:25 de ADN de control Recomendamos tener al menos 5000 lecturas que se asignen al genoma Lambda no metilado y 500 lecturas que se asignen al genoma pUC19 metilado con CpG con una longitud de lectura de 76 bases para tener suficiente cobertura para llamar con confianza a las eficiencias de conversión. P: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación? R: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación? Sí, se puede usar NaOH, aunque se recomienda la formamida por su mayor facilidad de manejo. Si se usa NaOH, la concentración de la solución debe ser precisa y el volumen añadido a la reacción debe ser exactamente de 4 μl. El NaOH es altamente corrosivo. Se deben seguir las normas de seguridad locales e institucionales al trabajar con NaOH. Si se realiza una dilución a partir de NaOH 2 N, asegúrese de que la solución madre tenga un pH mínimo de 12,5. Verifique el pH de la solución madre antes de usarla. Evite diluciones imprecisas preparando un volumen de NaOH diluido lo suficientemente grande como para minimizar los errores de pipeteo. Recomendamos preparar al menos 1 ml. Prepare diluciones de NaOH frescas o almacene alícuotas diluidas a -20 °C durante un máximo de 6 meses para evitar cambios en la concentración. El NaOH sólido es delicuescente (absorbe agua de la atmósfera). No se puede pesar con precisión. Por lo tanto, las soluciones preparadas a partir de pellets de NaOH deben titularse para alcanzar la concentración adecuada. P: ¿Son las bibliotecas de doble indexación compatibles con la secuenciación de extremo único? R: Sí, los oligos NEBNext para Illumina, incluidos los oligos de doble índice, son compatibles con la secuenciación de lectura única. Consulte la Guía general de secuenciación indexada de Illumina (versión actual) para obtener información sobre los flujos de trabajo de secuenciación de doble índice en una celda de flujo de lectura única o una celda de flujo de extremo emparejado. P: ¿Es normal que la solución de Fe(II) del producto EM-seq™ sea amarilla o se observe un cambio de color? R: Sí, se ha observado variación de color (de incolora a amarilla). Las pruebas no han demostrado ninguna diferencia en el rendimiento en función de esta variación. P: ¿Qué porcentaje de PhiX se necesita para las bibliotecas EM-seq™? R: Consulte las recomendaciones de Illumina®. Hemos tenido éxito con los siguientes porcentajes de PhiX: NovaSeq®: 5% PhiX NextSeq® 2000: 5% PhiX NextSeq 500/550: 35% PhiX MiSeq®: 5% PhiX P: ¿Puede almacenarse a largo plazo la solución de Fe(II) recién diluida? R: No. La solución de hierro recién diluida debe desecharse inmediatamente después de su uso. P: ¿El kit incluye cebadores? R: No. El kit puede usarse con los cebadores de doble índice únicos NEBNext LV. Para obtener una lista completa de cebadores de doble índice únicos de bajo volumen (LV), consulte la tercera columna de la tabla de selección de oligos multiplex NEBNext®. Para usar con los kits de preparación de bibliotecas NEBNext, consulte el manual del kit de preparación de bibliotecas. Los manuales de los cebadores de doble índice únicos NEBNext LV también contienen consejos para configurar las reacciones de ligadura. Para conocer las opciones de equilibrio de color, consulte el selector de oligonucleótidos de índice NEBNext® para obtener combinaciones de códigos de barras válidas. P: ¿Son compatibles las bibliotecas de doble indexación con la secuenciación de extremo único? R: Sí, los oligos NEBNext para Illumina, incluidos los oligos de doble índice, son compatibles con la secuenciación de lectura única. Consulte la Guía general de secuenciación indexada de Illumina (versión actual) para obtener información sobre los flujos de trabajo de secuenciación de doble indexación en una celda de flujo de lectura única o en una celda de flujo de extremo emparejado. P: ¿Es normal que la solución de Fe(II) del producto EM-seq sea amarilla o se observe un cambio de color? R: Sí, se ha observado una variación de color (de incolora a amarilla). Las pruebas no han mostrado ninguna diferencia en el rendimiento en función de esta variación. P: ¿Son direccionales o no direccionales las bibliotecas EM-seq? R: Las bibliotecas EM-seq son direccionales. P: ¿Se puede sustituir el adaptador EM-seq por otro adaptador? R: No se recomienda. El adaptador EM-seq se ha optimizado para su uso con el kit NEBNext Enzymatic Methyl-seq, y la sustitución por otro adaptador probablemente reducirá el rendimiento. P: ¿Puedo usar NaOH (hidróxido de sodio) en lugar de formamida para desnaturalizar mi ADN antes de la reacción de desaminación? R: Sí, se puede usar NaOH, aunque se recomienda usar formamida por su mayor facilidad de manejo. Si se usa NaOH, es fundamental que la concentración de la solución sea precisa y que el volumen añadido a la reacción sea exactamente de 4 μl. El NaOH es altamente corrosivo. Se deben seguir las normas de seguridad locales e institucionales al trabajar con NaOH. Si se realiza una dilución a partir de NaOH 2 N, asegúrese de que la solución madre tenga un pH mínimo de 12,5. Verifique el pH de la solución madre antes de usarla. Evite diluciones imprecisas preparando un volumen de NaOH diluido lo suficientemente grande como para minimizar los errores de pipeteo. Recomendamos preparar al menos 1 ml. Prepare diluciones de NaOH frescas o almacene alícuotas diluidas a -20 °C hasta por 6 meses para evitar cambios en la concentración. El NaOH sólido es delicuescente (absorbe agua de la atmósfera). No se puede pesar con precisión. Por lo tanto, las soluciones preparadas a partir de pellets de NaOH deben titularse para lograr la concentración adecuada. P: ¿Se puede almacenar el tampón TET2 "activo" durante más de 4 meses? R: No. El tampón TET2 "activo" debe desecharse después de 4 meses. P: ¿Qué tampones se recomiendan para el cizallamiento de ADN en los flujos de trabajo de metil-seq enzimático (EM-seq™) de NEB? R: Para usar con el kit NEBNext® Enzymatic Methyl-seq (NEB n.° E7120), el ADN debe cizallarse en uno de los siguientes tampones: Tris-HCl 10 mM pH 7,5 o pH 8,0, TE 1X (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM) o TE bajo (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM). No recomendamos cizallar el ADN de entrada en 0,1X TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA) ni en agua. Para su uso con el módulo de conversión enzimática de metil-seq NEBNext® (NEB n.° E7125), el ADN no debe estar en un tampón que contenga EDTA antes de proceder a la reacción de oxidación. Por lo tanto, se recomienda cizallar el ADN en 10 mM Tris pH 8,0. Como alternativa, si se cizalla en 1X TE o con baja TE, se requiere una limpieza de la columna o microesfera seguida de una elución en 10 mM Tris-HCl pH 8,0 o en agua sin nucleasas. P: ¿Cómo se deben analizar los datos de secuenciación de EM-seq™? R: Las bibliotecas de EM-seq secuenciadas ofrecen el mismo resultado que las bibliotecas de bisulfito, con la citosina secuenciada como timina y 5mC o 5hmC secuenciados como citosina. Se pueden utilizar pipelines establecidos para el análisis de datos de bisulfito. También disponemos de un pipeline de demostración y datos de ejemplo en la biblioteca de GitHub: https://github.com/nebiolabs/EM-seq/